Detección electroquímica de ácido úrico en saliva humana sin diluir utilizando electrodos integrados de papel de uricasa

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 12033 (2022) Citar este artículo

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En este estudio, presentamos un sensor electroquímico integrado de papel inmovilizado con uricasa (papel UOx) para la detección de ácido úrico (AU) en la saliva. El UOx se inmovilizó en la zona de detección en el sustrato de papel estampado con cera. Este papel UOx se integró con un electrodo de carbono serigrafiado modificado con azul de Prusia después de la electropolimerización de o-fenilendiamina para construir una celda electroquímica para muestras de pequeño volumen (20 μL). Primero, optimizamos las condiciones de fabricación del papel UOx. A continuación, se analizó la respuesta amperométrica del sensor de UA electroquímico basado en papel UOx utilizando una concentración conocida de solución estándar de UA en saliva artificial a un potencial aplicado de -0,1 V (frente al electrodo de pseudoreferencia de Ag). El sensor electroquímico de UA basado en papel UOx mostró una sensibilidad de 4,9 μA·mM−1 en un rango lineal de 50 a 1000 μM (R2 = 0,998), alta selectividad y buena reproducibilidad, así como un límite de detección de 18,7 μM ( 0,31 mg/dL) UA. Finalmente, cuantificamos los niveles de AU en muestras de saliva sin diluir de controles sanos (n = 20) y pacientes con gota (n = 8). Los niveles se correlacionaron con los medidos con ensayos enzimáticos convencionales de AU en saliva, así como con los niveles séricos de AU. El sensor de AU electroquímico basado en papel UOx es una herramienta conveniente y fácil de usar para evaluar los niveles de UA en saliva.

El ácido úrico (AU), el producto final del metabolismo de las purinas en el cuerpo humano, juega un papel importante en una variedad de condiciones fisiológicas y patológicas, incluida la gota1,2,3. El AU es un antioxidante y se ha informado que la hipouricemia está asociada con enfermedades neurológicas inmunomediadas o degenerativas, como la esclerosis múltiple, la enfermedad de Parkinson o la enfermedad de Alzheimer3. La estomatitis aftosa recurrente y el liquen plano oral también se asociaron con niveles bajos de AU salival4,5. Sin embargo, la hiperuricemia contribuye al desarrollo y progresión de la gota, síndrome metabólico, enfermedad renal crónica o enfermedades cardiovasculares3. Aunque la hiperuricemia no siempre induce la gota y el diagnóstico de gota no se basa únicamente en la hiperuricemia, la gota se desarrolla en sujetos con hiperuricemia que conduce a la deposición de cristales de urato monosódico en los tejidos. Directrices recientes para el tratamiento de la gota recomiendan que la terapia de reducción de urato debe optimizarse para lograr y mantener un nivel sérico de AU < 5-6 mg/dL, pero no < 3 mg/dL6,7. Por lo tanto, la monitorización de la AU sérica es indispensable para el diagnóstico, tratamiento y seguimiento de la hiperuricemia y la gota. Sin embargo, la punción venosa es invasiva y puede causar complicaciones, como lesiones y sangrado. Además, el análisis de suero AU requiere un entorno de laboratorio que utilice equipo especializado.

Los diagnósticos salivales han atraído una mayor atención en los campos que utilizan pruebas en el punto de atención (POCT) y en aplicaciones clínicas para monitorear enfermedades con frecuencia y facilidad, además de predecir los resultados posteriores al tratamiento porque la saliva refleja el estado fisiológico y patológico del cuerpo8 ,9. El AU se produce principalmente en el hígado y los intestinos. La mayor parte del AU se elimina a través de los riñones y los intestinos a través de transportadores de urato. Sin embargo, los transportadores de aniones orgánicos y uratos también se expresan en las glándulas salivales10. Además, varios estudios clínicos informaron una relación lineal entre los niveles de AU en suero y saliva en la mayoría de los casos, lo que sugiere el potencial de la determinación de AU en saliva como una alternativa para los análisis de sangre1,2,11,12. Se han desarrollado varios métodos analíticos que incluyen cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)13, electroforesis capilar (CE)14 y kits de ensayo colorimétrico enzimático15,16,17,18 para la detección de AU salival. Sin embargo, no son adecuados para el uso personal diario porque suelen consumir mucho tiempo y requieren expertos e instrumentos costosos. Aunque algunos kits de análisis enzimáticos disponibles en el mercado se pueden usar para varios tipos de matrices biológicas, como saliva, suero y orina2, pueden verse influenciados por otras interferencias, como la vitamina C, los lípidos o la peroxidasa endógena que están presentes en las muestras biológicas y, finalmente, provocar falsos resultados2,19,20,21,22. Además, tienen una fecha de caducidad corta porque la peroxidasa de los reactivos es incompatible con conservantes como la azida sódica23. Como resultado, un reactivo atrasado puede resultar en una disminución de su sensibilidad2,24.

Los sensores electroquímicos recibieron una atención significativa debido a las ventajas prácticas, que incluyen alta sensibilidad, tiempo de respuesta rápido, portabilidad, bajo costo y facilidad de operación para detectar AU salival25,26,27. Kim et al. informó un biosensor de protector bucal salival UA portátil que utiliza un sistema de electrodos serigrafiados (SPE) modificados con uricasa con electrónica inalámbrica integrada28. Aunque este biosensor de protector bucal podría monitorear el nivel de AU salival en tiempo real de forma continua, su uso está limitado debido a la incomodidad y el problema de biocompatibilidad de la electrónica. Huang et al. informaron sobre un dispositivo electroanalítico basado en papel para el análisis de AU salival29. Fabricaron compuestos de poli(3,4-etilendioxitiofeno)-óxido de grafeno sobre sustratos de óxido de indio y estaño (ITO) como electrodos de trabajo y cubrieron el electrodo preparado con un trozo de papel para construir una celda electroquímica de capa delgada. Aunque este dispositivo mostró una alta sensibilidad, su uso es inconveniente porque requiere electrodos de referencia y contraelectrodos separados. Por lo tanto, se necesita un método fácil, rápido, rentable y sensible para el análisis de AU salival para POCT de enfermedades asociadas a AU.

En este estudio, fabricamos un sensor de UA electroquímico sencillo y eficaz basado en un papel inmovilizado con uricasa (UOx) (papel UOx) y un electrodo de carbono serigrafiado modificado con azul de Prusia (PrB) (PrB-SPCE). Para mejorar la selectividad y la antiincrustación biológica del electrodo, se electropolimerizó o-fenilendiamina (o-PD) en PrB-SPCE (PPD/PrB-SPCE). El papel UOx que utiliza un tejido de limpieza de lentes con patrón de cera con un solo círculo se integró con el PPD/PrB-SPCE para construir una celda electroquímica para muestras de pequeño volumen. Primero, optimizamos las condiciones de fabricación para la inmovilización de UOx en el papel. A continuación, evaluamos el rendimiento analítico del sensor UA electroquímico integrado en papel UOx, basado en la sensibilidad, selectividad, reproducibilidad y estabilidad, en saliva artificial. Finalmente, el sensor electroquímico de AU integrado en papel UOx se evaluó determinando la concentración de AU en muestras de saliva sin diluir obtenidas de controles sin gota (n = 20) y pacientes con gota (n = 8), comparando los niveles de AU en suero y los medidos. con kits de ensayo enzimático UA salival Salimetrics® convencionales. El sensor electroquímico integrado en papel UOx para la detección de UA salival se representa esquemáticamente en la Fig. 1.

Representación esquemática del principio de detección y la señal de corriente resultante del sensor UA electroquímico basado en papel UOx y las concentraciones de ácido úrico (mg/dL) en muestras de saliva humana.

UA (≥ 99,0%), UOx (4 unidades/mg de Candida sp.), o-PD, sulfato de sodio (Na2SO4), cloruro de sodio (NaCl), cloruro de calcio (CaCl2), cloruro de potasio (KCl), ácido cítrico, tiocianato de potasio (KSCN), cloruro de amonio (NH4Cl), fosfato de potasio monobásico (KH2PO4), fosfato de potasio dibásico (K2HPO4), ácido L-láctico (LA), D-glucosa (Glu), ácido L-ascórbico (AA), acetaminofén (AP), la solución de albúmina sérica bovina (BSA) y glutaraldehído (GA) se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El papel de limpieza de lentes Whatman (grado 105) se solicitó a GE Healthcare Life Sciences (Pittsburgh, PA, EE. UU.). Todos los reactivos eran de grado analítico y se usaron sin purificación adicional. Todas las soluciones acuosas se prepararon recientemente utilizando agua desionizada (DW) con una resistividad de 18,2 MΩ · cm.

El papel con diseño de cera se preparó utilizando una impresora XeroxColorQube 8570 N (Fuji Xerox, Tokio, Japón) con software AutoCAD (Autodesk, San Rafael, CA, EE. UU.) para el diseño de patrones y un horno de secado BF-150C (DAIHAN Scientific, Seúl, EE. UU.). Corea) para la impregnación de cera. Todos los experimentos electroquímicos, incluida la voltamperometría cíclica y la cronoamperometría (CA), se llevaron a cabo con un Compactstat (Ivium Technology, Eindhoven, Países Bajos) a temperatura ambiente (TA). PrB-SPCE que contiene un electrodo de trabajo de carbono modificado con PrB (4 mm de diámetro), un contraelectrodo de carbono y un pseudoelectrodo de referencia de Ag se adquirió de DropSens (DRP-710, Llanera, Asturias, España).

El tejido de limpieza de lentes con barrera de cera hidrofóbica medía 11 mm de ancho y 15 mm de largo para un electrodo. La zona hidrofílica tenía 8 mm de diámetro (Fig. S1 [A] en Información complementaria (SI)). La impregnación uniforme de cera sobre el papel se realizó en un horno de secado BF-150C a 80 °C durante 120 s. Finalmente, el papel con diseño de cera se retiró del horno y se enfrió rápidamente a temperatura ambiente.

Para inmovilizar el UOx dentro del tejido de limpieza de lentes, se mezclaron 30 unidades de UOx (37,5 mg/mL) con 2 mg de BSA y 1 μL de solución de glutaraldehído al 8 % en 200 μL de tampón de fosfato de potasio (PB, 0,1 M, pH 7,0) , como se muestra en la Fig. S1(B) en SI. A continuación, se dejaron caer 10 μL de la solución mixta sobre el papel encerado estampado y se secó en una sala limpia (23,5 ± 1,0 °C, 25,0 ± 5,0 %) durante 40 min. Para eliminar la enzima no unida, este papel se lavó con PB 0,1 M. Finalmente, el papel UOx se secó en una sala limpia (23,5 ± 1,0 °C, 25,0 ± 5,0 %) durante 30 min.

Antes de la fabricación del sensor UA, confirmamos las propiedades electroquímicas de PrB-SPCE mediante voltamperometría cíclica en solución de KCl con un rango de potencial de -0,1 a 0,4 V (vs. pseudoelectrodo de referencia de Ag) y una velocidad de barrido de 50 mV/ s. A continuación, se depositó poli(o-PD) (PPD) en el PrB-SPCE mediante la polimerización de o-PD a 0,7 V (vs. electrodo de pseudoreferencia de Ag) durante 100 s en una solución de PB 0,1 M (pH 7,0) que contenía 10 o-PD mM y sulfato de sodio 5 mM para minimizar la bioincrustación y la interferencia de los constituyentes de la saliva28. A continuación, se unió al electrodo una sección de cinta adhesiva de doble cara con un orificio perforado (8 mm de diámetro). Finalmente, la cinta se cubrió con un papel inmovilizado con UOx para almacenar la solución de muestra y conectar eléctricamente el sistema de tres electrodos para la detección electroquímica.

La técnica CA se utilizó para evaluar la sensibilidad de detección de UA del papel UOx/PPD/PrB-SPCE. Se preparó una solución estándar de AU en saliva artificial que consistía en NaCl 5 mM, CaCl2 1 mM, KCl 15 mM, ácido cítrico 1 mM, KSCN 1,1 mM y NH4Cl 4 mM en DW28. El pH de la saliva artificial se ajustó a 6,7. Se detectaron varias concentraciones de AU utilizando la técnica de CA a un potencial aplicado de -0,1 V (frente al pseudoelectrodo de referencia de Ag) durante 60 s después de 1 min de incubación en la solución estándar. La curva de calibración se obtuvo a partir de mediciones de CA en 20 μL de AU en un rango de concentración de 50 a 1000 μM en saliva artificial.

Este estudio y la recolección de muestras fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Bundang de la Universidad Nacional de Seúl (IRB No. B-1911-577-303) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Inscribimos a 8 pacientes varones con gota (edad [media ± error estándar de la media (SEM)], 39,1 ± 3,0 años) y 20 varones sin gota (edad 40,8 ± 6,4 años). Las muestras de suero y saliva se recolectaron simultáneamente en condiciones de ayuno. Además, obtuvimos 16 muestras pareadas de pacientes con gota antes y después de comenzar la terapia para reducir el urato (febuxostat (n = 4), alopurinol (n = 3) o benzbromarona (n = 1)). La duración del tratamiento fue de 2,9 ± 1,1 meses. Se recogieron muestras de saliva entera sin estimular mediante babeo pasivo en un tubo de plástico. Las muestras de sangre venosa se centrifugaron (1500 × g durante 15 min a temperatura ambiente) para obtener suero. Todas las muestras de saliva se centrifugaron a 4500 × g durante 10 min a 4 °C. Todas las muestras se congelaron a -80 °C hasta su análisis. Los niveles séricos de AU se determinaron utilizando kits de ensayo colorimétrico enzimático disponibles comercialmente (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el análisis de UA salival, primero se dejaron caer 20 μL de muestra de saliva sin diluir en el papel UOx/PPD/PrB-SPCE. Después de la incubación durante 60 s, la medición de CA se realizó a -0,1 V (frente al pseudoelectrodo de referencia de Ag) durante 60 s. La concentración de AU en la muestra de saliva se calculó a partir de la pendiente de la curva de calibración. Además, los niveles de AU en saliva se midieron utilizando un kit de ensayo enzimático de AU en saliva (Salimetrics LLC, Filadelfia, PA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las variables continuas se presentan como media ± SEM. Se utilizó la prueba t de muestras independientes para la comparación de los dos grupos. Se utilizó la prueba t pareada para comparar los niveles de AU antes y después de la terapia de reducción de urato. Se usó ANOVA unidireccional para comparar los niveles de UA en 3 grupos y se realizó la prueba exacta de Fisher para analizar datos categóricos. Se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson para analizar la relación entre los niveles de AU en suero y saliva o entre los niveles de AU en saliva medidos por el sensor de AU preparado y el método convencional. Se consideró un valor de p de 0,05 para la significación estadística. El análisis estadístico se realizó con IBM® SPSS Statistics, versión 25 (IBM Corporation, Armonk, NY, EE. UU.).

Por lo general, los biosensores de UA han utilizado enzimas como UOx con alta especificidad para UA. Sin embargo, como la detección amperométrica de AU basada en UOx generalmente requiere un potencial relativamente alto (> + 0,65 V) para medir el producto de peróxido de hidrógeno (H2O2), está sujeto a varias interferencias electroactivas. La PrB o hexacianoferrato férrico se ha denominado "peroxidasa artificial", porque puede mejorar el transporte de electrones y catalizar la reducción de H2O2 con un sobrepotencial bajo30,31. Por lo tanto, PrB-SPCE proporciona detección catódica selectiva de H2O2 producido por la reacción enzimática de UA. Sin embargo, la PrB puede descomponerse en soluciones neutras o débilmente alcalinas32. Además, la saliva es una matriz compleja y difícil de manejar debido a su alta viscosidad y ensamblaje proteico, así como otras especies electroactivas33. Para mejorar la estabilidad, selectividad y biocompatibilidad de PrB-SPCE, introdujimos una membrana polimérica protectora externa como PPD en PrB-SPCE mediante electropolimerización. La membrana de PPD es conocida por su capacidad para penetrar compuestos de bajo peso molecular como H2O2 y rechazar otras especies electroactivas como AA y AP, así como evitar la bioincrustación en el electrodo28,34. Para caracterizar la propiedad electrocatalítica de PPD/PrB-SPCE hacia H2O2, realizamos mediciones de voltamperometría cíclica en saliva artificial con y sin 1 mM de H2O2 en el rango de potencial de − 0,20 a + 0,40 V (vs. Ag pseudo-electrodo de referencia) a una tasa de exploración de 50 mV/seg. Como se muestra en la Fig. 2a, el PPD/PrB-SPCE exhibió la actividad redox característica del blanco de Prusia (PrW)/PrB (0,02/0,13 V) en la solución de saliva artificial. La corriente máxima catódica aumentó a -12,3 μA a -0,00 V en una solución de H2O2 1 mM. Para confirmar el rendimiento electroquímico de PPD/PrB-SPCE frente a H2O2, se utilizó la técnica de CA a un potencial aplicado de -0,1 V (vs. pseudoelectrodo de referencia de Ag). La selectividad de PPD/PrB-SPCE fue confirmada por la respuesta actual de H2O2 en presencia de niveles fisiológicos de los constituyentes electroactivos relevantes de la saliva, incluidos UA, AA y AP. Como se muestra en las figuras 2b y 2c, las corrientes de interferencia debidas a UA (1000 μM), AA (500 μM) y AP (500 μM) fueron insignificantes, en comparación con la fuerte respuesta debida a H2O2 (50, 100 y 200 µM). En particular, las respuestas actuales de AA (− 0,12 ± 0,02 μA, [media ± desviación estándar]) y AP (− 0,06 ± 0,002 μA) en PPD/PrB-SPCE fueron significativamente más bajas que las de PrB-SPCE (− 0,17 ± 0,01 μA para AA y − 0,14 ± 0,01 μA para AP, respectivamente). Sin embargo, la corriente catódica de H2O2 (−0,35 μA ± 0,01 μA) en PPD/PrB-SPCE y PrB-SPCE (−0,38 ± 0,01 μA) fue similar. Este resultado indica que PPD/PrB-SPCE tiene una alta selectividad para la detección de H2O2 sin ningún efecto de interferencia por posibles especies electroactivas en la saliva. Además, la membrana externa de PPD no inhibió la permeabilidad de H2O2 hacia PrB-SPCE.

(a) Voltamogramas cíclicos de PPD/PrB-SPCE en una solución de saliva artificial con y sin H2O2 1,0 mM a un potencial que oscila entre −0,2 y 0,4 V (vs. pseudoelectrodo de referencia de Ag) y una velocidad de barrido de 50 mV/seg. . (b) Respuesta actual a 0, 50, 100 y 200 μM H2O2 de PPD/PrB-SPCE en comparación con la respuesta a interferencias electroactivas comunes, incluidas 1000 μM UA, 500 μM AA y 500 μM AP. (c) Comparación de la respuesta electroquímica de PPD/PrB-SPCE y PrB-SPCE a H2O2 50 μM y UA 1000 μM, y AA 500 μM y AP 500 μM, respectivamente, a − 0,1 V (vs. Ag pseudo-referencia electrodo). Efecto de ( d ) concentración de UOx, ( e ) volumen de gota de la mezcla de UOx y ( f ) método de inmovilización de UOx en el análisis de 1000 μM UA. Las barras de error representan la desviación estándar de la media (n = 3).

Las plataformas analíticas basadas en papel tienen varias ventajas, incluido el bajo costo, la fabricación simple y son fáciles de usar en muchas aplicaciones, como sensores bioquímicos y analíticos35. Además, el papel se puede diseñar fácilmente de acuerdo con el patrón deseado imprimiendo en cera con un reactivo no tóxico. Para utilizar el papel como herramienta bioanalítica para la detección de AU, diseñamos una sola zona que se integró al sistema de tres electrodos de SPCE. A continuación, inmovilizamos UOx dentro de la zona hidrófila del papel de lente con patrón de cera para usar como área de absorción de muestras y como celda electroquímica para facilitar la reacción entre UOx y UA dentro de las muestras. Por lo tanto, fue necesario optimizar las condiciones experimentales, incluido el tipo de papel, la concentración de UOx y el volumen de la mezcla de UOx para una inmovilización eficiente de UOx en el papel.

Primero, optimizamos los tipos de papel, incluido Whatman No. 1, No. 114 y pañuelos de limpieza de lentes No. 105 para la inmovilización de UOx. Como el tamaño y el grosor de los poros difieren según el tipo de papel (Tabla S1), el resultado de la detección varía debido a las diferencias en el caudal de la solución en la superficie del papel y la uniformidad del material36. Por lo tanto, la selección del papel apropiado parece ser fundamental para mejorar la señal actual de los biosensores basados ​​en papel. El efecto del tipo de papel se investigó de acuerdo con la respuesta de corriente catódica de UOx-paper/PPD/PrB-SPCE en 1000 μM UA a − 0,1 V (vs. Ag pseudo-electrodo de referencia). Como se muestra en la Fig. S1 (C), la corriente UA fue la más alta en el tejido de limpieza de lentes, que era el más delgado y tenía los poros más anchos. Para mejorar la respuesta electroquímica del papel UOx/PPD/PrB-SPCE, optimizamos la concentración de UOx y el volumen de gota de la mezcla de UOx. La Figura 2d muestra el cambio en la respuesta de corriente catódica de papel UOx/PPD/PrB-SPCE a − 0,1 V (vs. pseudoelectrodo de referencia de Ag) según la concentración de UOx (0, 12,5, 25, 37,5, 50, y 62,5 mg/mL). La corriente de UA aumentó con el aumento de la concentración de UOx de 12,5 a 37,5 mg/ml. A medida que aumentaba aún más la concentración de UOx, disminuía la corriente catódica de UOx/PPD/PrB-SPCE. Además, cuando la concentración de UOx se fijó en 37,5 mg/mL, se encontró que el volumen de gota óptimo de la mezcla de UOx era de 10 μL (Fig. 2e)). El aumento del volumen de gota de la mezcla de UOx resultó en una disminución de la señal de corriente.

GA es uno de los reactivos bifuncionales más utilizados para el entrecruzamiento intermolecular de proteínas que forma enlaces covalentes a partir de la reacción entre los aldehídos del entrecruzante y las aminas de la proteína37,38. Pero cuando las enzimas se entrecruzan directamente con GA, tienden a perder actividad. Por lo tanto, un entrecruzamiento suave con GA utilizando un alimentador rico en grupos amino como BSA puede aumentar la estabilidad de la enzima al reducir la modificación química de los grupos amino internos de la enzima39. Además, puede reducir la porosidad de la película y, por lo tanto, aumentar la capacidad de respuesta de la película40. Como resultado, el papel UOx preparado con GA y BSA como reticulante y estabilizador generó una corriente más alta (-5,04 ± 0,35 μA) que el papel preparado solo con UOx (-4,03 ± 0,14 μA) (Fig. 2f). El recuadro muestra la imagen teñida de papel UOx usando Ponceau S, que generalmente se usa para la detección de proteínas en membranas de acetato de celulosa y nitrocelulosa41. Las proteínas en el papel UOx se tiñeron de rojo con tinte Ponceau S. Según la señal actual y la imagen teñida del papel UOx, confirmamos que el UOx se inmovilizó con éxito en el papel. Las condiciones óptimas de 37,5 mg/mL de UOx y 10 μL de mezcla de UOx con BSA y GA en las toallitas limpiadoras de lentes No. 105 se usaron en otros experimentos.

Investigamos el rendimiento analítico de UOx-paper/PPD/PrB-SPCE para la detección de UA utilizando la técnica CA. Las respuestas actuales de UOx-paper/PPD/PrB-SPCE en 20 μL de soluciones de saliva artificial que contenían varias concentraciones de UA (01000 μM) se midieron a un potencial aplicado de −0,1 V (vs. Ag pseudo-electrodo de referencia). Como se muestra en la Fig. 3a, la corriente catódica de papel UOx/PPD/PrB-SPCE aumentó con el aumento de la concentración de UA. La respuesta del UOx-papel/PPD/PrB-SPCE fue lineal respecto a la concentración de AU hasta 1000 μM (R2 = 0,998), con un límite de detección de 13,3 μM según la desviación estándar del blanco y el método de la pendiente ( 3 sbl/pendiente)42 y una sensibilidad de detección de 5,0 μA·mM−1 (39,8 μA·mM−1·cm−2). Sin embargo, la respuesta actual de UOx-membrana/PPD/PrB-SPCE, en la que UOx se inmovilizó directamente en PPD/PrB-SPCE usando GA y BSA, fue menor que la de UOx-papel/PPD/PrB-SPCE. Como resultado, la pendiente de la curva de calibración de UOx-papel/PPD/PrB-SPCE fue aproximadamente tres veces mayor que la de UOx-membrana/PPD/PrB-SPCE (1,7 μA·mM−1). La Tabla 1 presenta una comparación del rendimiento de detección de nuestro UOx-papel/PPD/PrB-SPCE con el de otros SPCE basados ​​en UOx para la detección de AU salival. El rendimiento de nuestro sensor UA fue bueno en términos de bajo volumen de muestra y amplio rango lineal, junto con una sensibilidad moderada. En particular, su rango de detección incluía todas las concentraciones de AU en saliva desde controles sanos hasta pacientes con gota.

(a) La curva de calibración de la corriente catódica frente a la concentración de UA en la comparación de UOx-papel/PPD/PrB-SPCE y UOx-membrana/PPD/PrB-SPCE a − 0,1 V (vs. Ag pseudo-electrodo de referencia) , respectivamente. (b) La respuesta actual a 500 μM UA de papel UOx/PPD/PrB-SPCE a − 0,1 V (frente al pseudoelectrodo de referencia Ag) en comparación con la respuesta a interferencias fisiológicas electroactivas comunes que incluyen glucosa 800 μM, AA 200 μM, 100 μM AP y 1000 μM LA. ( c ) Reproducibilidad de UOx-paper/PPD/PrB-SPCE con diferentes fechas de fabricación, según la respuesta actual a 500 μM UA en saliva artificial a − 0,1 V (vs. Ag pseudo-electrodo de referencia). ( d ) Estabilidad de UOx-paper/PPD/PrB-SPCE basada en la respuesta actual a 500 μM UA almacenada durante 28 días a 4 °C. Las barras de error representan la desviación estándar de la media (n = 3).

Para evaluar la selectividad del UOx-paper/PPD/PrB-SPCE, comparamos las respuestas actuales de 500 μM UA con la de otras posibles sustancias que interfieren, incluidas 800 μM Glu, 200 μM AA, 100 μM AP y 1000 μM LA. Como se muestra en la Fig. 3b, solo UA indujo un cambio drástico en la corriente eléctrica, mientras que las corrientes de interferencia causadas por Glu, AA, AP y LA fueron insignificantes. Este resultado mostró que UOx-paper/PPD/PrB-SPCE tenía una alta selectividad para la detección de AU sin efectos asociados con posibles interferencias. Además de los interferentes, la biomolécula no específica o la adsorción microbiana es una amenaza persistente y generalizada para las interfaces expuestas a fluidos biológicos, por lo que la función de los biosensores puede verse parcial o totalmente afectada43. El PPD es conocido por tener propiedades antibioincrustantes en medios proteicos, posiblemente debido a su mayor compacidad44,45. Probamos la capacidad antiincrustante biológica del papel UOx/PPD/PrB-SPCE usando saliva artificial y muestras de saliva real. Como se muestra en la Fig. S2, la respuesta actual de UOx-paper/PPD/PrB-SPCE a UA (300 μM) que se añadió en saliva real retuvo el 86% y el 92% de la saliva artificial. Pero UOx-paper/PrB-SPCE sin PPD mostró 63% y 68% de su respuesta actual en saliva real en relación con saliva artificial. Por lo tanto, pensamos que PPD podría ser efectivo para minimizar la adhesión no específica de proteína en la superficie del electrodo.

Además, investigamos la reproducibilidad de UOx-paper/PPD/PrB-SPCE midiendo la respuesta actual a UA (500 μM) usando 10 sensores en diferentes fechas de fabricación. Como el coeficiente de variación (CV) de nuestro sensor UA fue del 4,8% (Fig. 3c), el papel UOx/PPD/PrB-SPCE fue altamente reproducible. La estabilidad se probó evaluando la respuesta actual de UOx-paper/PPD/PrB-SPCE a 500 μM UA durante 28 días de almacenamiento a 4 °C. Como se muestra en la Fig. 3d, no hubo cambios significativos en la corriente en 28 días (~ 97 % de la respuesta inicial), lo que sugiere la estabilidad del papel UOx/PPD/PrB-SPCE.

La saliva es un fluido biológico que se utiliza en el diagnóstico clínico y el manejo de pacientes, debido a sus muchas ventajas, incluida la recolección no invasiva, la muestra fácil de usar y el almacenamiento económico48. Sin embargo, su uso rutinario está limitado por una mayor dilución de los analitos, la interferencia de los alimentos o el estado de salud de las glándulas salivales o periodontales. En particular, la saliva es una matriz difícil y compleja para el análisis biológico porque muchos componentes de la saliva pueden afectar la respuesta del analito de interés49. Por lo tanto, se requiere un método altamente sensible y selectivo para la detección de AU en saliva.

Para evaluar la viabilidad de nuestro sensor de AU para POCT, medimos las concentraciones de AU en saliva de controles sin gota (n = 20) y pacientes con gota (n = 8). Además, en el caso de pacientes con gota, determinamos los niveles de AU en saliva antes y después de la terapia de reducción de urato. Los resultados se compararon con los de ensayos enzimáticos comerciales de AU en saliva (Salimetrics®), junto con los niveles séricos de AU como valores de referencia.

Primero, los niveles séricos de AU fueron significativamente más altos en pacientes con gota (10,23 ± 0,36 mg/dL, media ± SEM) que en los controles sin gota (6,20 ± 0,22 mg/dL, p = 8,77 × 10−10; Fig. 4a) . La hiperuricemia (definida como AU sérico ≥ 7,0 mg/dL) fue significativamente más prevalente en el grupo de gota que en el grupo de control (100 % frente a 20 %, p = 1,59 × 10−10). La terapia reductora de urato disminuyó el AU sérico en 3/8 (37,5 %) pacientes con gota a concentraciones inferiores a 6,0 mg/dL.

Niveles de ácido úrico (AU) en suero y muestras de saliva entera no estimuladas. (a) Los pacientes con gota (n = 8) mostraron niveles significativamente más altos de AU en suero o saliva que los sujetos de control (n = 20, todos p < 0,05). Los niveles de AU en saliva medidos con nuestro sensor de UA fueron significativamente más bajos que los niveles de AU en suero y saliva medidos a través de ensayos colorimétricos enzimáticos convencionales tanto en controles como en casos de gota (ambos p < 0,0001 por ANOVA). Las barras de error representan el error estándar de la media. (b) Los niveles de AU en suero o saliva (medidos con Salimetrics® y el sensor UA) se correlacionaron positivamente de manera significativa entre sí.

A continuación, los niveles de AU en saliva fueron de 2,34 ± 0,25 mg/dL en el grupo de control y de 7,51 ± 1,09 mg/dL en el grupo de gota según el ensayo Salimetrics® (p = 0,002, Fig. 4a); Los niveles de AU en saliva fueron un 37,7% más bajos en los sueros de los controles y un 73,4% en los sueros de los pacientes con gota. En el caso del sensor de AU fabricado, los niveles de AU en saliva fueron de 1,05 ± 0,15 mg/dL en el grupo de control y de 3,54 ± 0,81 mg/dL en el grupo de gota (p = 0,018; Fig. 4a). Estos niveles salivales correspondieron al 34,6 % y al 16,9 % de los niveles séricos de AU en los grupos de gota y control, respectivamente. En ambos métodos, los niveles de AU en saliva fueron significativamente más altos en el grupo de gota que en el grupo de control, aunque fueron significativamente más bajos que los niveles de AU en suero. Los resultados fueron consistentes con los de estudios previos11,12,13,14. Sin embargo, los niveles de AU en saliva basados ​​en el ensayo Salimetrics® fueron significativamente más altos que los obtenidos con el sensor de UA preparado que involucraba a todos los sujetos (p = 5,26 × 10−13), particularmente altos en el rango de concentración bajo por debajo de 2 mg/dL por el sensor de UA (Figura 4b). Esta diferencia de niveles de AU en saliva entre dos métodos puede atribuirse a la gran variabilidad del kit de prueba enzimática a la baja concentración de AU, junto con interferencias debidas a compuestos endógenos. Y también puede provenir de la difusión reducida de moléculas de señal en el sensor UA preparado. En primer lugar, el ensayo Salimetrics® utiliza una mezcla de reacción enzimática que permite la detección de AU mediante la producción de un cromógeno rojo. UOx es oxidar UA a alantoína y H2O2. Y luego el H2O2 se usa en la segunda reacción enzimática por la peroxidasa para formar un cromógeno que se mide cuantitativamente a una longitud de onda de 515 (o 520) nm. Aunque este ensayo enzimático es simple y está disponible comercialmente, la formación de cromógenos por la reacción de H2O2 catalizada por peroxidasa es susceptible a la interferencia de los componentes endógenos de confusión en las matrices biológicas y, eventualmente, puede causar resultados falsos positivos o negativos19,20,21,22. El ensayo Salimetrics® requiere centrifugación para eliminar las mucinas y otras interferencias de las muestras de saliva, pero no puede eliminar a la perfección múltiples compuestos que pueden actuar como interferencias. En segundo lugar, evaluamos la precisión entre días usando el estándar UA (5 mg/dL) y los controles (Alto y Bajo) en el mismo kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como se muestra en la Tabla S2, el CV para el estándar de AU que se usó para el cálculo de la concentración de UA fue del 8,8 % y el control alto (estimado en 8,6 mg/dl) mostró un CV inferior al 5 %. Pero el CV para el control-Bajo (estimado en 2,5 mg/dL) llegó al 36 % (Tabla S2). Este resultado puede atribuirse a la sensibilidad relativamente baja a las bajas concentraciones de AU. Y puede causar algunas limitaciones de los ensayos enzimáticos, como la gran desviación de los resultados de las pruebas y la variabilidad de un kit a otro, que se han mencionado en varios estudios2,19,24,50. Por el contrario, el CV del sensor de AU fue inferior al 5 % en un rango de concentración bajo de 1,7 a 5 mg/dL (Tabla S3). Y el sensor UA preparado, papel UOx/PPD/PrB-SPCE que no usó peroxidasa, se fabricó con dos tipos de membrana, incluido papel UOx y PPD para minimizar la interferencia debida a múltiples componentes dentro de la saliva. Pero estas capas protectoras pueden reducir la difusión de la molécula señal, lo que resulta en una disminución de los niveles de AU. Sin embargo, los niveles de AU salival medidos en el grupo control concuerdan con estudios previos analizados por HPLC-UV o método electroquímico14,29,50. Además, el nivel medio de AU en saliva en el grupo de gota que utilizó el sensor UA fue 3,37 veces mayor que en el grupo de control, que fue similar a 3,21 veces en el ensayo Salimetrics®. Los niveles de AU en suero y saliva medidos a través de dos métodos se correlacionaron significativamente entre sí (los coeficientes de correlación de Pearson oscilaron entre 0,631 y 0,788, Fig. 4b).

La terapia de reducción de urato redujo significativamente los niveles séricos de AU en el grupo de gota de 10,23 ± 0,36 mg/dl a 7,84 ± 0,84 mg/dl (p = 0,015), como se muestra en la Fig. 5a. Aunque los niveles de AU en saliva tendieron a disminuir de 7,51 ± 1,09 a 5,78 ± 0,90 mg/dL en el ensayo Salimetrics® y de 3,54 ± 0,81 a 2,75 ± 0,95 mg/dL con el sensor de UA, no se observó significación estadística. Como se muestra en la Fig. 5b, cuando se utilizó el ensayo Salimetrics®, los cambios en el nivel de ácido úrico en saliva no se correlacionaron con los niveles séricos de AU. Sin embargo, nuestro sensor de AU reveló que el cambio en los niveles de AU en saliva se correlacionó significativamente con el cambio en los niveles de AU en suero (coeficiente de correlación de Pearson = 0,982). Podría atribuirse a la reducción de la interferencia del sensor de AU, lo que da como resultado una detección precisa de AU en la saliva, incluso en el rango de concentración bajo de AU. Como resultado, el sensor de AU propuesto es altamente confiable para la medición de AU salival. Las ventajas de nuestro sensor de AU, papel UOx/PPD/PrB-SPCE, incluyen: (1) sensibilidad y especificidad para AU en saliva humana sin diluir; (2) detección de AU en un volumen pequeño (20 μL) de muestra de saliva; (3) detección rápida (dentro de solo 2 min) de UA (incubación 1 min + detección 1 min) y la facilidad de uso. Por lo tanto, el sensor de AU fabricado se puede utilizar como una herramienta simple, rápida y confiable para determinar los niveles de UA en saliva, que pueden reflejar el nivel de UA en suero.

Cambio en los niveles de ácido úrico (AU) en suero y muestras de saliva entera no estimuladas después de la terapia de reducción de urato. (a) En pacientes con gota (n = 8), los niveles séricos de AU disminuyeron significativamente después del tratamiento. Sin embargo, los niveles de AU en saliva no cambiaron significativamente independientemente del método utilizado. (b) Los cambios en el AU sérico se correlacionaron significativamente con los cambios en los niveles de AU en saliva medidos con nuestro sensor de UA (p < 0,0001), pero no con el ensayo Salimetrics®.

En resumen, presentamos un sensor UA electroquímico simple y confiable que utiliza papel UOx integrado con PPD/PrB-SPCE. El papel UOx actúa como área de absorción de la muestra para la reacción entre UOx y UA, además de servir como filtro para evitar la interferencia dentro de la saliva. PPD mejora la selectividad y la antiincrustación biológica del electrodo. Como resultado, el papel UOx/PPD/PrB-SPCE preparado mostró una sensibilidad robusta para UA, con un amplio rango lineal, alta selectividad y buena reproducibilidad, y requiere un volumen de muestra bajo. Usando este sensor de UA, medimos los niveles de UA en saliva sin diluir ni estimular, y luego comparamos los niveles de UA en suero con los basados ​​en ensayos de UA convencionales (Salimetrics®). Aunque los niveles de AU en saliva determinados por los ensayos de Salimetrics® fueron significativamente más altos que los medidos con nuestro sensor de UA, se correlacionaron significativamente con los niveles de UA en suero. Además, nuestro sensor de UA mostró que los cambios en el nivel de UA en saliva reflejan cambios en los niveles de UA en suero con más precisión que el ensayo Salimetrics®. Por lo tanto, esperamos que el sensor de AU preparado, papel UOx/PPD/PrB-SPCE, se utilice en POCT para evaluar los niveles de AU en saliva en sujetos con enfermedades asociadas a AU.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Esta investigación fue apoyada por la subvención del Fondo de Desarrollo de Dispositivos Médicos de Corea financiada por el gobierno de Corea (el Ministerio de Ciencia y TIC, el Ministerio de Comercio, Industria y Energía, el Ministerio de Salud y Bienestar, el Ministerio de Seguridad de Alimentos y Medicamentos) [ N.º de proyecto KMDF_PR_20200901_0023, 1711137928] y subvención de la Fundación Nacional de Investigación financiada por el gobierno de Corea (n.º NRF-2021R1A2C1093825).

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Yun Jong Lee y Gi-Ja Lee.

Departamento de Ingeniería Médica, Universidad Kyung Hee, Escuela de Graduados, Seúl, 02447, República de Corea

Seong Hyun Han y Gi-Ja Lee

División de Reumatología, Departamento de Medicina Interna, Hospital Bundang de la Universidad Nacional de Seúl, Seongnam-si, Gyeonggi-do, 13620, República de Corea

You-Jung Ha, Eun Ha Kang y Yun Jong Lee

División de Reumatología, Gobierno Metropolitano de Seúl-Centro Médico Boramae de la Universidad Nacional de Seúl, Seúl, 07061, República de Corea

kichul shin

Departamento de Desarrollo de Dispositivos Médicos, Escuela de Graduados de la Universidad Nacional de Seúl, Seongnam-si, Gyeonggi-do, 13605, República de Corea

Yun Jong Lee

Departamento de Ingeniería Biomédica, Facultad de Medicina, Universidad Kyung Hee, #1 Kyungheedae-ro, Dongdaemun-gu, Seúl, 02447, República de Corea

gi ja lee

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Y.-JH, YJL y G.-JL contribuyeron a la concepción y el diseño del estudio. Todos los autores realizaron la preparación del material, la recopilación y el análisis de datos. El primer borrador del manuscrito fue escrito por SHH y G.-JL, y YJL, EHK, Y.-JH y KS comentaron versiones anteriores del manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Yun Jong Lee o Gi-Ja Lee.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Han, SH, Ha, YJ., Kang, EH et al. Detección electroquímica de ácido úrico en saliva humana sin diluir utilizando electrodos integrados de papel de uricasa. Informe científico 12, 12033 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16176-5

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Recibido: 16 de marzo de 2022

Aceptado: 06 julio 2022

Publicado: 14 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16176-5

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