rápido y etiqueta

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 21413 (2022) Citar este artículo

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En este trabajo, demostramos el desarrollo de un biosensor electroquímico rápido y sin etiquetas para detectar Listeria monocytogenes utilizando un nuevo material de nanocepillo de tiomero de estímulo-respuesta. Los nanocepillos se desarrollaron mediante la codeposición simultánea en un solo paso de nanoplatino (Pt) y tiomeros de alginato (tiomero ALG). La plataforma de nanocepillo ALG-tiomero/Pt aumentó significativamente el área superficial electroactiva promedio de los electrodos en 7 veces y mantuvo las propiedades de activación (hinchazón osmótica estimulada por el pH) del alginato. El comportamiento dieléctrico durante el accionamiento del cepillo se caracterizó con sondas redox cargadas positiva, neutra y negativamente por encima y por debajo del punto isoeléctrico del alginato, lo que indica que la carga superficial del tiomero ALG juega un papel importante en la adquisición de la señal. La plataforma ALG-thiomer se biofuncionalizó con un aptámero selectivo para la proteína internalina A en Listeria para aplicaciones de biodetección. Se optimizó la carga de aptámeros y se investigaron varias estrategias de captura de células (cepillo extendido versus colapsado). La captura celular máxima se produce cuando el ALG-tiomero/aptámero está en la conformación extendida (pH > 3,5), seguido de la medición de la impedancia en la conformación colapsada (pH < 3,5). Se detectaron bajas concentraciones de bacterias (5 CFU mL−1) a partir de una matriz alimentaria compleja (caldo de pollo) y las pruebas de selectividad frente a otras bacterias grampositivas (Staphylococcus aureus) indican que se mantiene la afinidad del aptámero, incluso a estos valores de pH. El nuevo material blando híbrido se encuentra entre los más eficientes y rápidos (17 min) para la biodetección de L. monocytogenes hasta la fecha, y no requiere pretratamiento de la muestra, lo que constituye una nueva plataforma de materiales prometedores para la detección de moléculas o células pequeñas.

Listeria monocytogenes es una bacteria virulenta transmitida por los alimentos, omnipresente en el medio ambiente (suelo y agua) que causa cientos de muertes en los EE. UU. cada año1,2. Cada año, se informan casi 48 millones de casos de enfermedades transmitidas por los alimentos, casi el 19 % de los cuales se deben a la infección por Listeria monocytogenes, lo que tiene un impacto económico negativo potencial de $15 mil millones debido a los costos de atención médica, la pérdida de productividad y la pérdida de vidas3,4. Con síntomas como dolor muscular, náuseas, diarrea, vómitos y escalofríos1, L. monocytogenes se encuentra entre los patógenos transmitidos por los alimentos más mortales, con una tasa de mortalidad de hasta el 30 % en personas de alto riesgo5,6. Es particularmente peligroso para las mujeres embarazadas, aunque generalmente se recuperan, es posible que sus bebés no sobrevivan2.

Listeria monocytogenes es un patógeno difícil de monitorear en entornos de procesamiento de alimentos debido a su capacidad para proliferar en condiciones de bajo contenido de humedad, alta salinidad o a temperaturas asociadas con unidades de refrigerador/congelador comunes7. La Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA), el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y la Unión Europea (UE)1 implementaron una regla de tolerancia cero para L. monocytogenes en los alimentos listos para el consumo. El creciente número de retiros de alimentos relacionados con la contaminación por Listeria en los últimos años8 refuerza aún más la necesidad de métodos de detección de patógenos en tiempo real que puedan identificar productos alimenticios contaminados antes de que lleguen al público.

El estado del arte actual para la detección de Listeria en plantas de procesamiento de alimentos, incluidos los recuentos viables totales (TVC), ELISA (ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas) y PCR (reacción en cadena de la polimerasa), son susceptibles a errores y lecturas falsas. y requieren entornos de laboratorio costosos con personal altamente capacitado para completar9,10. Los resultados de las pruebas de estos métodos se retrasan severamente al requerir dos pasos de enriquecimiento consecutivos (hasta 48 h) para concentrar/amplificar bacterias antes de un paso de detección cualitativa11, porque estos métodos carecen de sensibilidad [~ 100 CFU mL−1 límites de detección (LOD) ]12,13 y no puede detectar directamente niveles bajos de patógenos en muestras complejas como medios, caldos o tejidos homogeneizados.

Las técnicas de detección electroquímica se estudian ampliamente para diferentes aplicaciones debido a sus ventajas inherentes de robustez, respuesta rápida, facilidad de uso, miniaturización, alta sensibilidad, bajos límites de detección, pequeños volúmenes de analitos, capacidad para trabajar con muestras turbias y capacidades sin etiquetas12, 14 Es importante tener en cuenta estas propiedades cuando se analizan muestras ambientales y de alimentos en una planta de procesamiento donde se requieren dispositivos fáciles de usar y una preparación de muestra simple15,16. Se sabe que la deposición de nanopartículas metálicas (como el platino) y/o polímeros en la superficie de los sensores electroquímicos mejora significativamente el área superficial y/o la conductividad eléctrica, además de mejorar la inmovilización del agente de biorreconocimiento, lo que da como resultado una mayor sensibilidad, una captura más rápida y una mejor detección de la bacteria diana17. El papel de las nanopartículas de platino dentro del campo de la biodetección ha sido revisado recientemente por Yu et al.18, quienes resumen sus propiedades, incluidas las altas densidades de corriente, el transporte de masa rápido y las propiedades electrocatalíticas mejoradas que dan como resultado indicadores clave de rendimiento del sensor mejorados19,20,21 ,22.

Los aptámeros son oligonucleótidos monocatenarios y, si se seleccionan correctamente y se aplican en el tampón de unión correcto, muestran una alta afinidad hacia los objetivos23. Los aptámeros se unen específicamente a través de interacciones de objetivos y estructuras expuestas24,25. Los aptámeros tienen numerosas ventajas sobre los anticuerpos, incluido el bajo costo de síntesis, la alta reproducibilidad, la alta estabilidad térmica y la capacidad de modificar y/o integrar varios grupos funcionales (p. ej., biotinilación, tiolación, etc.)25,26. Las revisiones exhaustivas sobre tecnologías basadas en aptámeros para la detección de patógenos transmitidos por los alimentos resumen los desarrollos recientes en biosensores ópticos y electroquímicos (es decir, aptasensores)24,27,28, incluidas plataformas que utilizan perlas magnéticas conjugadas con aptámeros de ADN y sensores de fibra óptica funcionalizados con anticuerpos y aptámeros para detección de células de L. monocytogenes en productos cárnicos listos para el consumo contaminados29. Hills et al.30 y Oliveira et al.31 informaron de un mecanismo de detección para la detección de L. monocytogenes en muestras de alimentos mediante la actuación de distintos nanocepillos de quitosano-aptámero utilizando el aptámero descubierto por Ohk et al.29. Recientemente, Sidhu et al.32 desarrollaron un aptasensor utilizando microelectrodos interdigitados de platino funcionalizados con este mismo aptámero de ADN para Listeria spp. detección en caldo de verduras y medios hidropónicos mediante la incorporación del sensor en una trampa de partículas/sedimentos para el análisis del agua de riego in situ.

El uso de polímeros sensibles a estímulos para la actuación en aplicaciones de detección ha atraído una atención cada vez mayor en los últimos años, como se resume en una revisión reciente de Hu et al.33. Los polímeros sensibles a estímulos experimentan cambios importantes en solubilidad, volumen y/o conformación en respuesta a estímulos externos, y se han utilizado para imitar la capacidad de respuesta natural a los cambios externos en el entorno que se observa en los sistemas vivos33,34,35. El alginato de sodio es un polisacárido natural no tóxico, biodegradable y de bajo costo que contiene ácidos manurónico y gulurónico repetitivos. El alginato es una molécula aniónica con un pKa de aproximadamente 3,5. Por encima del pKa, el alginato es hidrófilo y en ambientes por debajo de este pH es hidrófobo36,37. Trabajos anteriores han utilizado la activación de polímeros para mejorar la captura de bacterias38 y, recientemente, Hills et al.30 y Giacobassi et al.39 estudiaron la activación de polímeros sensibles a estímulos tanto para la captura como para la detección de patógenos en medios complejos. Estos estudios demostraron con éxito que al controlar la actuación del polímero a microescala, los patógenos pueden capturarse cuando el polímero se extiende y la transducción de señales mejora después de colapsar el polímero en la superficie del sensor30,39. Sin embargo, estos estudios previos utilizaron nanopartículas de metales y polímeros en una deposición capa por capa para producir los sensores30,40, lo que requiere un proceso de fabricación de varios pasos. Uno de los mayores desafíos en estos trabajos anteriores fue unir el nanocepillo a la superficie seguido de la biofuncionalización, que utilizó técnicas de entrecruzamiento que no eran específicas, y el control del grado de unión de la superficie frente a la inmovilización del biorreceptor fue un desafío.

Aquí, nos enfocamos en el desarrollo de una co-electrodeposición de un solo paso de tiomeros de alginato y nanoplatino como una plataforma de aptasensor. Nos basamos en esta plataforma única de tiomero de alginato (tiomero ALG) para desarrollar un biosensor rápido y sin etiquetas para detectar L. monocytogenes. Estudios previos han mostrado co-electrodeposición de alginato y otros materiales conductores como grafito y MnO2-C41,42, pero hasta donde sabemos, nuestro trabajo es el primero en mostrar la electrodeposición simultánea de ALG-tiomeros y platino para biodetección, que abre una nueva y emocionante área de investigación para el desarrollo de nano-biosensores. Optimizamos las condiciones de deposición de ALG-tiomero bajo diferentes combinaciones de voltaje, concentración de ALG-tiomero y ciclos de sonoelectrodeposición, logrando un aumento de hasta siete veces en el área de superficie electroactiva para la mejor condición. Nuestros resultados muestran que la relación señal-ruido más alta se logró cuando la captura de células se produjo en la conformación de cepillo extendido y la detección en la conformación de cepillo colapsado. Finalmente, demostramos que el biosensor ALG-thiomer/Pt nanobrush puede detectar selectivamente L. monocytogenes en una matriz alimentaria en concentraciones tan bajas como 5 CFU mL−1 y en presencia de otras células Gram-positivas en menos de 17 min sin la necesidad de preconcentración de muestras o técnicas de marcaje redox.

El fosfato de sodio dibásico, el fosfato de potasio monobásico, la hidroquinona (C6H4(OH)2, el ácido cloroplatínico (8 % p/p) y el cloruro de hexaaminarutenio(III) (Ru(NH3)6Cl3) se adquirieron de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO). La suspensión de alúmina (0,05 µm) y las microsuspensiones de diamante policristalino (3 µm y 1 µm) se adquirieron de Buehler (Lake Bluff, IL). Referencia de plata/cloruro de plata (Ag/AgCl), trabajo de platino/iridio (Pt /Ir, 1,6 mm de diámetro) y los electrodos auxiliares de platino se adquirieron de BASinc (West Lafayette, IN). El acetato de plomo (30 % p/v) se obtuvo de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). 1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida HCl (EDC) y sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Trihidrato de ferrocianuro de potasio (K4Fe(CN)6 ·3H2O) de Ward's Science (Rochester, NY) Clorhidrato de cisteína monohidrato y ferricianuro de potasio (K3Fe(CN)6) de JT Baker (Phillipsburg, NJ). Sal sódica del ácido algínico (baja viscosidad), N-hidroxisuccinimida (NHS), hilo de platino (99,95 % Pt, 1,5 mm de diámetro), 5,5′-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) (reactivo de Ellman) y 2- El tampón de ácido (morfolino)etanosulfónico) (MES) se obtuvo de Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Los aptámeros creados por Ohk et al.29 que se dirigen a la proteína de membrana Internalina A de L. monocytogenes (KD = 103 CFU/ml, 47 bases de ADN y 15 008 g/mol) se obtuvieron de Gene Link Inc. (Hawthorne, NY). El extracto de levadura, el caldo de soja tríptico (TSB), el agua de peptona tamponada (BPW) y el agar de soja tríptico (TSA) se obtuvieron de Becton, Dickson and Company (Sparks, MD). El caldo de verduras no perecedero (UHT, procesado a temperatura ultra alta) se adquirió en una tienda de comestibles local. El tubo de diálisis (DiaEasy™, MWCO de 3,5 kDa) se obtuvo de Biovision (Milpitas, CA). El cloruro de potasio (KCl) y el cloruro de sodio (NaCl) se adquirieron de EMD Millipore Corporation (Burlington, MA). El nitrato de potasio (KNO3) se adquirió de British Drug Houses (ON, Canadá). El tampón de ácido tris-etilendiaminotetraacético (TE) (pH 7,4) se obtuvo de Quality Biological (Gaithersburg, MD). El caldo de fosfato de triptosa (TPB) se obtuvo de HiMedia (Mumbai, India).

Los cultivos de bacterias, Listeria monocytogenes (ATCC 15313) y Staphylococcus aureus (ATCC 25923), se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se usaron como bacterias diana e interferente para las pruebas de sensibilidad y selectividad, respectivamente. Para realizar experimentos con los microorganismos patógenos S. aureus y L. monocytogenes se utilizaron los estándares de bioseguridad de nivel 2 establecidos por el Instituto Nacional de Salud. Todos los cultivos de bacterias almacenados inicialmente a -80 °C se transfirieron a medios de crecimiento, TPB para L. monocytogenes y TSB para S. aureus, mediante transferencias duplicadas idénticas y secuenciales, y se incubaron en condiciones aeróbicas durante 24 h a 35 °CS aureus y L. monocytogenes se mantuvieron a 4 °C durante un máximo de 3 meses en agar de soja tríptico (TSA) y TSA con extracto de levadura al 0,6 % (p/v) (TSAYE), respectivamente. Se llevaron a cabo transferencias inclinadas a medios de crecimiento para preparar cultivos de bacterias para análisis. Las muestras de bacterias se enumeraron primero diluyendo en serie las muestras en BPW y sembrando en TSA y TSAYE para S. aureus y L. monocytogenes, respectivamente; después de 48 h a 35 °C; los resultados se registraron como UFC mL−1.

El alginato de sodio se modificó para incorporar una terminación del grupo tiol mediante la formación de un enlace amida entre los grupos de ácido carboxílico del alginato de sodio y los grupos amino primarios de la cisteína utilizando el acoplamiento mediado por carbodiimida como en Jindal et al.43. En este método, los grupos carboxilo del alginato se activan con EDC a pH 6 durante 45 min. Luego, se añadió monohidrato de clorhidrato de cisteína en una proporción de peso de 2:1 (alginato:cisteína) y se dejó reaccionar durante 2 h a pH 4 seguido de otra 1 h a pH 6 (consulte la Fig. 1 para conocer los pasos de fabricación). La reacción se realizó bajo agitación continua a temperatura ambiente.

Esquema de los pasos para la fabricación, biofuncionalización y detección de los cepillos ALG-thiomer/Pt funcionalizados con aptámero selectivo para L. monocytogenes. Primero, los tiomeros ALG se forman en base a la reacción del alginato de sodio con cisteína utilizando la química de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida (EDC). Luego, el tiomero ALG y el platino se sonoelectrodepositan simultáneamente en el electrodo de trabajo, lo que da como resultado cepillos de tiomero ALG/Pt que se muestran a través de imágenes SEM. A continuación, los cepillos ALG-tiomero/Pt se funcionalizaron con aptámero a través de la química de reticulación de carbodiimida. La estrategia de detección consistió en la activación del cepillo ALG-tiomero/Pt desde los estados colapsados a los extendidos en función de los cambios de pH: la captura de bacterias se realizó a pH 7 con los cepillos en el estado extendido seguido de la medición (detección) cuando los cepillos colapsaron a pH 3.

A continuación, la solución se dializó (límite de peso molecular de 3,5 kDa) para aislar el conjugado de alginato-cisteína (ALG-tiomero). La diálisis incluyó dos días frente a HCl 1 mM (pH 4), seguido de 1 día en HCl 1 mM y NaCl al 1 % (p/v) y otros dos días en HCl 1 mM (todas las soluciones se cambiaron dos veces al día) . Posteriormente, la suspensión se liofilizó (-50 °C, -0,120 mBar, 48 h) en una unidad Labconco FreeZone 6 (Labconco, Kansas City, MO, EE. UU.). Los tiomeros ALG se almacenaron posteriormente en atmósfera de nitrógeno a 5 °C hasta su uso para la modificación del sensor.

El grado de modificación logrado en el alginato se determinó cuantificando la cantidad de grupos tiol mediante el análisis de Ellman según las instrucciones de Thermo Fisher Scientific44. Brevemente, las muestras y el 5,5′-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico), es decir, el reactivo de Ellman, se mezclaron en tampón de fosfato que contenía EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) a pH 8 y se midió su absorbancia a 412 nm frente a un control en blanco. utilizando un espectrofotómetro (Genesys 10S, Thermo Scientific, Waltham, MA). Se preparó una curva estándar utilizando monohidrato de clorhidrato de cisteína para cuantificar la concentración de tiol (expresada como μmol de grupos tiol g−1).

El alginato y el platino se depositaron simultáneamente (Fig. 1) sobre la superficie de los electrodos de trabajo de platino/iridio (previamente pulidos según las instrucciones del fabricante) utilizando el método de sonoelectrodeposición desarrollado por Taguchi et al.19. En este método, una fuente de alimentación conectaba un alambre de platino (ánodo) y el electrodo de trabajo (cátodo) aplicaba un potencial fijo durante 1 s seguido de 1 s de sonicación a la solución de deposición, como ciclos alternos. La solución de deposición contenía ácido cloroplatínico al 0,72 % (p/v), acetato de plomo al 0,001 % (p/v) y tiomero ALG en diferentes concentraciones (0,05, 0,075 y 0,1 % p/v). También se evaluaron voltajes de 1.5, 5.75 y 10 V para 60, 100 y 140 ciclos de sonoelectrodeposición para determinar las condiciones óptimas de deposición.

Se utilizó microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (SEM) para analizar la morfología de la mejor condición de deposición de cepillo basada en los experimentos electroquímicos. Después de recubrir el electrodo modificado con cepillos ALG-thiomer/Pt con una capa de platino de 5 nm de espesor [Cressington sputter coater 208 HR (Watford, Reino Unido)], se tomaron imágenes SEM con un FEI Quanta 600 FEG (Hillsboro, OR ). Se utilizaron aumentos de 10.000 y 16.000 veces con un voltaje de aceleración de 10 kV para la formación de imágenes de la superficie.

La química de la superficie de los electrodos revestidos utilizando la deposición de cepillo optimizada seleccionada se analizó mediante espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS), realizada en un Omicron ESCA + (Scienta Omicron, Suecia) con pistola de electrones CN10 y pistola de rayos X dual Mg/Al .

Cada paso de la preparación del biosensor (deposición de alginato-platino, carga de aptámero y detección de bacterias) se caracterizó electroquímicamente utilizando un sistema de celdas de 3 electrodos (electrodos de trabajo, de referencia de Ag/AgCl y auxiliares de platino) a temperatura ambiente utilizando voltamperometría cíclica (CV) y /o métodos de espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) descritos por Burrs et al.17 usando un potenciostato/analizador de impedancia CHI 600E. La prueba de CV se realizó en una solución de Fe(CN)63− 4 mM en KNO3 1 mM con velocidades de exploración de 50, 100, 150 y 200 mV/s, potencial de conmutación de 650 mV y tiempo de reposo de 10 s. Se utilizó CV para obtener el área de superficie electroactiva (ESA en cm2) de los electrodos a través de la teoría de Randles-Sevcik utilizando la pendiente de la corriente frente a la raíz cuadrada de la velocidad de exploración (ip frente a v1/2), como se informó previamente19,45 (ver información de apoyo para más detalles). Los valores de ESA se utilizaron para determinar los mejores parámetros de deposición (concentración de ALG-tiomero, voltaje y número de ciclos de sonoelectrodeposición, como se describe en la deposición de ALG-Thiomer/Platinum nanobrsuh), así como para caracterizar la actuación del cepillo y determinar la concentración de carga de aptámero. (ver información de apoyo para más detalles).

Para las pruebas de actuación se utilizaron una sonda cargada negativamente (KFeCN63−), una sonda neutra (C6H4(OH)2) y una sonda cargada positivamente Ru(NH3)63+. El pH de la solución de la sonda redox se ajustó a pH 7 o pH 3 usando una solución de HCl o NaOH 1 M. El pH de la solución redox se controló durante las pruebas de CV para garantizar que el pH informado no cambiara en más de 0,5 unidades de pH. También se llevaron a cabo pruebas de actuación en presencia de una concentración constante de Listeria de fondo de 103 CFU mL−1 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando EIS para determinar la estrategia de captura y medición más eficiente entre la conformación extendida y colapsada de los cepillos.

Se utilizó EIS para determinar el límite de detección (LOD), el rango de detección y la sensibilidad del biosensor cuando se expone a bacterias en concentraciones que varían de 101 a 106 CFU mL−1 (curva estándar). Para el procedimiento de funcionalización de los cepillos ALG-thiomer/Pt con aptámeros, consulte la información de apoyo para conocer los detalles. El análisis se realizó con un potencial de CC inicial de 0 V, una amplitud de CA de 100 mV y un rango de frecuencia de 1 a 100 000 Hz. Las pruebas de sensibilidad se realizaron inicialmente en PBS y luego nuevamente en caldo de vegetales comercialmente estéril. A partir de los diagramas de Bode (impedancia frente a frecuencia), se utilizó el valor de impedancia a una frecuencia de corte fija para construir las curvas de calibración, que consisten en la impedancia (Ohm) frente a la concentración de células (log CFU mL−1). A partir de las curvas de calibración (R2 > 0,97), se obtuvo la sensibilidad a la bacteria diana utilizando la pendiente de la porción lineal y luego se utilizó el método 3σ para calcular el límite de detección (LOD)39. Se utilizó el cambio de impedancia ($\mathrm{\Delta Z}= {Z}_{bacteria}-{Z}_{no \, bacteria}$) para ilustrar el rendimiento de los electrodos independientemente del medio. La selectividad a L. monocytogenes se evaluó determinando la sensibilidad y el LOD en presencia de la misma concentración de otra bacteria Gram-positiva (S. aureus) en PBS y en caldo vegetal estéril.

Los resultados de los experimentos independientes se realizaron al menos por triplicado y se expresaron como media ± desviación estándar. Se utilizó el software SPSS para realizar el análisis estadístico. Se usó ANOVA (análisis de varianza unidireccional) para probar la significación y se expresó en el nivel de p < 0,05. Se separaron medias significativamente diferentes mediante la prueba de Tukey.

La eficacia de la reacción de ALG-tiomero se evaluó primero mediante el análisis de Ellman. El resultado obtenido fue de 1050 ± 200 μmol de grupos tiol g−1 de polímero, unas 3 veces superior al contenido de tiol de 324,54 μmol g−1 presentado por Jindal et al.43 con un procedimiento similar. En nuestro enfoque, el EDC (un compuesto de carbodiimida) reacciona con los grupos de ácido carboxílico del alginato para formar un intermedio activo de O-acilisourea que se reemplaza por los grupos amino primarios de la cisteína, formando un enlace amida con el grupo carboxilo original (ver Fig. . 1). Se puede incluir N-hidroxisuccinimida (NHS) en la reacción para mejorar la eficiencia ya que el EDC acopla NHS a carboxilos formando un éster de NHS que es considerablemente más estable que el intermedio de O-acilisourea46. Marcano y Sabino47 reportaron un valor mayor de 1939 μmol g−1 de grupos tiol al incluir NHS en la reacción de activación con EDC. Sin embargo, este enfoque introduce grupos funcionales adicionales que pueden entrecruzarse, reduciendo la capacidad de controlar la actuación del cepillo e introduciendo errores experimentales.

La presencia del grupo tiol en el análisis de Ellman indica que el azufre está presente en la muestra pero no proporciona información sobre el estado del azufre (grupo sulfhidrilo reactivo u oxidado) ya que el grupo tiol es muy susceptible a la oxidación al exponerse al oxígeno atmosférico. con posible formación de enlaces tipo disulfuro o enlaces cruzados (–S–S–)47.

Se realizó un análisis XPS para caracterizar los enlaces químicos para la mejor condición de deposición relacionada con la respuesta electroquímica (consulte la información de respaldo para ver los resultados detallados y la discusión). El espectro XPS de la deposición en cepillo de ALG-tiomero/Pt (Fig. 2a) muestra la deposición efectiva de los componentes ALG-tiomero y Pt, con picos característicos de C 1s, O 1s, N 1s y S 2p de ALG-tiomero y Pt 4f de platino. El pico de N 1s a 399 eV cae dentro del rango de los complejos de cisteína-metal48. La energía de enlace de 400 eV puede estar asociada con la presencia del grupo amina40 o con la cisteína49. De manera similar, Wang et al.50 y Li et al.51 presentaron pequeños picos de S 2p y N 1s en el mismo rango que en el presente trabajo, lo que indica la presencia de estos componentes en puntos de carbono (complejos de citrato trisódico-cisteína al comparar su XPS espectro completo con cisteína pura) y monocapa autoensamblada de alcanotiol sobre Pt metálico, respectivamente. La energía de enlace S 2p de 164 eV (Fig. 2b) es característica del tiol52 o su coordinación con los iones metálicos48. El pico a 162,5 eV (S 2p) también está dentro del rango esperado para los enlaces metal-azufre52. Yang y Agrios53 asociaron un doblete en la región S 2p de un ácido 4-mercaptobenzoico modificado con Pt a valores ligeramente inferiores (161,84 eV y 163,04 eV) a los obtenidos en el presente trabajo (162,5 eV y 164 eV) a la formación de un Pt –Bono S. Castner et al.54 también informaron que la energía de enlace de 161.9 eV es consistente con los átomos de azufre unidos a la superficie de oro como una especie de tiolato. El pico de S 2p en la vecindad de 168,5 eV podría deberse a la presencia de azufre oxidado48,53. El espectro de Pt 4f (Fig. 2c) presenta dos picos a 71 eV y 74,3 eV correspondientes a Pt unido al S, lo que es consistente con los informes de la literatura para Pt en contacto con átomos de S 53,55. Romanchenko et al.56 asignaron la energía de enlace de 71,5 eV a las nanopartículas metálicas de Pt0 y de 74 eV a los compuestos de Pt(IV)-S, lo que también podría ser el caso en el presente estudio ya que: (1) el Pt podría estar depositándose directamente en el la superficie del electrodo, así como la unión al tiomero ALG antes del depósito, y (2) la electrodeposición usando ácido cloroplatínico involucra cationes Pt(IV) y su reducción a Pt057. En general, los espectros XPS que se muestran en la Fig. 2 indican la unión entre las nanopartículas de Pt y los átomos de S en el tiomero ALG.

Análisis de espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS). (a) espectro de estudio, (b) espectro de S 2p y (c) espectro de Pt 4f que muestra la codeposición exitosa de ALG-tiomero y Pt en los electrodos. Las líneas sólidas con curvas suaves son del software XPS Peak utilizado para identificar los picos S 2p y Pt 4f.

La morfología de los cepillos de nanoplatino y alginato para la mejor condición de deposición relacionada con la respuesta electroquímica (véanse los detalles en los resultados de la información de respaldo y la discusión) se muestra en la Fig. 3. La deposición del cepillo de ALG-tiomero/Pt formó esferoides yuxtapuestos (nodos terminales del cepillo) con diámetros que van desde 80 a 400 nm con un recubrimiento uniforme con algunas estructuras aleatorias en forma de coliflor distribuidas por toda la superficie. Chen et al.42 presentaron una estructura similar, aunque más suave, al electrodepositar simultáneamente alginato y compuesto de MnO2-C. Asimismo, Giacobassi et al.39 demostraron una estructura esferoide similar aunque más porosa y tridimensional con la deposición de cepillos de PNIPAAm sobre capas reducidas de óxido de grafeno y platino. De manera similar a los cepillos PNIPAAm descritos por Giacobassi et al.39, la electrodeposición de cepillos de ALG-tiomero/Pt condujo a la formación de cepillos homogéneos con una distribución uniforme de tamaños de eje y nodo. Según Taguchi et al.19, el método de sonoelectrodeposición pulsada promueve una mayor transferencia de masa a la superficie del electrodo, lo que da como resultado una deposición uniforme del material. Las estructuras relativamente grandes y suaves obtenidas en el presente trabajo son de esperar ya que el complejo ALG-tiomero co-depositado es un material polimérico significativamente grande, lo cual también fue observado por Giacobassi et al.39. La forma de los esferoides aumenta el área de la superficie, lo que da como resultado un aumento significativo del área de la superficie electroquímica en relación con el electrodo desnudo (consulte los resultados y la discusión en la información de respaldo). Además, se espera que la configuración del cepillo en combinación con la activación del cepillo dé como resultado una mayor exposición de los aptámeros al medio y la posterior unión de bacterias, como informaron anteriormente Giacobassi et al.39 y Hills et al.30 (consulte las secciones de resultados "ALG- activación del cepillo de tiomero/Pt y captura de Listeria spp." y "Prueba de rendimiento del biosensor"). Se debe realizar una mayor investigación sobre los efectos de los diferentes parámetros de deposición en la morfología considerando la importancia de la morfología para el rendimiento de detección.

Imágenes de microscopía electrónica de barrido de ALG-thiomer/Pt brush a 10 kV y (a) 10 000 y (b) 16 100 aumentos, respectivamente, que muestran una formación de cepillo uniforme y deposición sobre la superficie del electrodo con nodos terminales que oscilan entre 80 y 400 nm en diámetro.

El alginato es un polímero ácido que tiene un valor de pKa entre 3,2 y 4 (para los ácidos gulurónico y manurónico, respectivamente)37,58. Normalmente, por debajo del pKa del alginato, los grupos de ácido carboxílico se protonizan en la forma COOH y el polímero se colapsa. A medida que aumenta el pH de la solución, el COOH se ioniza a COO− y la repulsión electrostática resultante entre estos grupos hace que el polímero se extienda37,59,60. Para probar si la propiedad de activación del estímulo de pH del alginato se vio afectada por su modificación y para caracterizar las interacciones electrostáticas durante la activación en la superficie del electrodo, se llevaron a cabo pruebas de CV con tres sondas redox diferentes y se calcularon los valores de ESA (Fig. 4a) . Se utilizaron una sonda cargada negativamente (KFeCN63−), una sonda neutra (C6H4(OH)2) y una sonda cargada positivamente Ru(NH3)63+. Además, CV se llevó a cabo a pH de 3 y 7, por debajo y por encima del pKa del polímero, respectivamente (Fig. 4a), durante tres ciclos repetitivos.

(a) Interacciones electrostáticas durante tres ciclos de actuación entre pH 3 y pH 7 de los cepillos ALG-thiomer/Pt con diferentes sondas redox: una sonda cargada positivamente (Ru(NH3)63+, una sonda cargada negativamente (KFeCN63−), y una sonda neutra (C6H4(OH)2).(b) Impedancia total promedio para el cepillo ALG-thiomer/Pt funcionalizado con aptámero 400 nM y expuesto a 103 CFU mL−1 de Listeria monocytogenes a diferentes frecuencias de corte para varias capturas/medidas estrategias basadas en la actuación. "EX" se refiere al estado extendido (pH 7), "COL" se refiere al estado del cepillo colapsado (pH 3), "cap" se refiere a la captura de células y "meas" se refiere a la medición. desviación estándar de la media aritmética de al menos tres repeticiones; letras diferentes representan medias significativamente diferentes (p < 0,05).

Como se muestra en la Fig. 4a, por encima del pKa (pH 7), el transporte de electrones disminuye con la sonda KFeCN63− debido a la repulsión de carga/obstáculo estérico a medida que el grupo carboxilato de alginato tiene carga negativa; con la sonda neutra (C6H4(OH)2) la transferencia de electrones se ve menos afectada pero aun así puede ocurrir cierta hinchazón debido a la repulsión electrostática intramolecular entre los grupos carboxilato (COO-) del alginato59; y con la sonda Ru(NH3)63+, la corriente máxima y el ESA aumentan debido a las interacciones electrostáticas. Por debajo del pKa (pH 3) ocurre lo contrario, se favorece la transferencia de electrones con la sonda negativa aumentando el pico de corriente y ESA, mientras que el pico de corriente y ESA se reducen con la sonda positiva. Oliveira et al.31 y Hills et al.30 también observaron un comportamiento similar de aumento o reducción de ESA debido a interacciones electrostáticas o repulsión, respectivamente, para la activación de quitosano con las mismas sondas redox. Con la actuación repetitiva, la corriente máxima y la ESA cambiaron ligeramente (Fig. 4a) entre repeticiones; sin embargo, el cambio porcentual no fue significativo sin histéresis observable, lo que indica que la actuación del cepillo ALG-tiomero/Pt es reversible y puede repetirse varias veces (al menos 3 veces) desde estados colapsados a estados extendidos. Estos resultados son una mejora con respecto a Hills et al.30 y Giacobassi et al.39, la actuación con cepillo de quitosano y PNIPAAm, respectivamente, que informaron histéresis de actuación entre repeticiones.

El cepillo ALG-tiomero/Pt se convirtió en un aptasensor mediante la funcionalización con 400 nM de aptámero terminado en amino a través de la reticulación de carbodiimida, como se muestra en la Fig. 1 (consulte la información de respaldo para obtener más detalles). Basado en el principio de que la unión de la bacteria objetivo al aptámero disminuye la transferencia de electrones en la superficie del electrodo, que se mide como un aumento de la impedancia, se realizaron pruebas de actuación con EIS para determinar los valores de pH óptimos para capturar y detectar L. monocytogenes. . Para estos experimentos se utilizó una concentración constante de L. monocytogenes de 103 UFC mL−1 en PBS. En la Fig. 4b, la conformación de cepillo extendido a pH > 3,5 se indica como (EX), la conformación de cepillo colapsado a pH < 3,5 se indica como (COL), el estado de captura celular se indica con (tapa) y el paso de medición electroquímica es anotado por (meas). La captura de celdas en la conformación extendida (pH 7) y la detección en estado colapsado (pH 3) proporcionaron los valores de impedancia más altos (p < 0.05) para todas las frecuencias de corte y, por lo tanto, la eficiencia de detección (consulte también los diagramas de Bode en la Fig. S3 en el información de soporte). La captura óptima de bacterias objetivo en la forma extendida puede estar relacionada con un área de contacto más alta con la solución probada y una mayor probabilidad de interacción aptámero-célula, en comparación con el pH 3 en el que se contraen los cepillos y los sitios de unión del receptor. ) puede ser inaccesible. De manera similar a nuestro trabajo anterior sobre esta estrategia de captura, es probable que las células se enreden en la matriz polimérica durante el paso de detección, donde la unión del aptámero-objetivo ya no puede ser el mecanismo para la captura celular, sino más bien el enredo durante el colapso del nanocepillo. La especificidad de esta plataforma de detección radica en la afinidad inicial entre el aptámero y el objetivo a pH 7 (nanocepillo de tiomero ALG extendido), donde el colapso a pH 3 probablemente provoca cambios en la estructura secundaria del aptámero, pero también atrapa células en la matriz polimérica.

Este hallazgo sobre la estrategia de captura es consistente con los resultados informados por Hills et al.30 y Giacobassi et al.39 que también presentaron una mayor eficiencia de detección utilizando la estrategia EX/cap → COL/meas para la detección de patógenos. Además, la modificación del alginato con cisteína seguida de la unión del aptámero, usando sus grupos carbonilo, parece neutralizar las cargas negativas del alginato que normalmente causarían repulsión electrostática a la membrana altamente cargada negativamente (en la mayoría de las condiciones) de L. monocytogenes61. Este método de captura de bacterias es bastante simple en comparación con otros reportados en la literatura, como el método de Malic et al.62 que desarrolló un dispositivo de separación magnética de alto gradiente adaptado a nanopartículas inmunomagnéticas basado en una trampa magnética 3D integrada en un dispositivo microfluídico polimérico para captura magnética y liberación de L. monocytogenes.

Las propiedades dieléctricas de los tejidos biológicos se caracterizan por tres dispersiones que incluyen: (a) dispersión α que ocurre a baja frecuencia, asociada con interfaces de tejido, como membranas; (b) dispersión β en radiofrecuencia, provocada por la polarización de membranas celulares, proteínas y otras macromoléculas orgánicas; y (c) dispersión γ a frecuencia de microondas, asociada con la polarización de las moléculas de agua. Las membranas celulares actúan como barreras aislantes a bajas frecuencias, lo que demuestra vías resistivas, mientras que a frecuencias más altas demuestra una alta capacitancia. En consecuencia, los datos de actuación de EIS se utilizaron para determinar la frecuencia de corte (FC). Este análisis se realizó en un rango de frecuencia de 1 a 50 Hz, que corresponde a la región de dispersión de frecuencia alfa de los tejidos biológicos. La señal de impedancia máxima (p < 0,05) se observó en CF de 1 Hz (Fig. 4b) y se seleccionó para determinar los indicadores clave de rendimiento (KPI) para el aptasensor en medios complejos y mezclas de bacterias en la siguiente sección.

EIS evaluó la capacidad de los electrodos depositados con cepillos ALG-tiomero/Pt funcionalizados con 400 nM de aptámero terminado en amino para detectar L. monocytogenes. Consulte la información de apoyo para obtener detalles sobre la funcionalización del biosensor y los resultados sobre la concentración óptima de carga de aptámeros en cepillos ALG-thiomer/Pt (Fig. S2). En el campo de los biosensores, EIS es particularmente conveniente para la detección de eventos de unión en la superficie del transductor sin necesidad de etiquetas (como colorantes fluorescentes, enzimas, redox o compuestos radiactivos)63. El término impedimétrico surge porque la interfase ofrece (al ocupar los centros receptivos) un impedimento eléctrico para la transferencia de cargas que aumenta en función de la unión del blanco a la interfase, lo que permite la biodetección sin marcaje64. Las diferencias de impedancia causadas por la presencia de bacterias (que oscilan entre 100 y 103 CFU mL−1) se obtuvieron utilizando la estrategia EX/cap → COL/meas (pH 7 → 3). El tiempo total de la prueba fue de 17 min, que incluyó 15 min para la captura de bacterias y 2 min para la medición de EIS. Los diagramas de Bode se muestran en un rango de frecuencia de 1 Hz a 100 kHz; las inserciones son una vista ampliada del rango de frecuencia más bajo (1–5 Hz). Con base en el análisis de frecuencia de corte (FC) presentado en la Fig. 4b, todas las curvas de calibración se desarrollaron utilizando datos de diagramas de Bode para una FC de 1 Hz.

La Figura 5 muestra el electrodo nanohíbrido ALG-tiomero/Pt/aptámero calibrado para L. monocytogenes (y = 39,21x + 631,64, R2 = 0,99) y en presencia de S. aureus (y = 69,34x + 719,16, R2 = 0,98). La prueba de selectividad se realizó con Staphylococcus aureus debido a su similitud con Listeria como bacteria Gram-positiva y a que ambos son patógenos conocidos de transmisión alimentaria además de tener tamaños similares (0,5-2 µm). La adición de una concentración igual de S. aureus en la solución de prueba no mostró una interferencia significativa (p > 0,05) en el LOD (4,5 ± 0,8 CFU mL-1 con L. monocytogenes solo y 5,7 ± 2,1 CFU mL-1 con ambos). bacterias), lo que indica que no hay reacción cruzada entre el sensor y S. aureus. La sensibilidad aumentó (p < 0,05) de 39,21 ± 2,61 Ω/log (UFC ml−1) con L. monocytogenes solo a 69,34 ± 2,79 Ω/log (UFC ml−1) cuando también estaba presente S. aureus. El rango lineal también cambió de 101 a 106 CFU mL-1 con solo L. monocytogenes en PBS a 101–105 CFU mL-1 en la mezcla de bacterias. Ohk et al.29 presentaron un LOD de 103 UFC mL−1 usando el mismo aptámero en un biosensor de fibra óptica para detectar Listeria spp. Recientemente, Oliveira et al.31 utilizando el mismo aptámero presentaron LOD similares en comparación con el estudio actual para L. monocytogenes solo en PBS y en presencia de S. aureus, 2,5 y 2,6 UFC mL−1, respectivamente; utilizando la actuación de cepillos de quitosano/platino. Si bien se informa que los sensores de anticuerpos son propensos a dar reacciones falsas positivas con S. aureus, que también es un portador de proteína A, se demostró que el aptámero utilizado en el presente trabajo es selectivo para L. monocytogenes29. Este aptámero se dirige a la proteína de superficie Internalina A, que es una de las principales proteínas de invasión involucradas en la patogénesis29. A pesar de que esta proteína es estructuralmente análoga a ciertas proteínas de la pared celular con repeticiones internas identificadas en miembros de los géneros Staphylococcus y Streptococcus65, los presentes resultados corroboran que este aptámero puede ser selectivo para L. monocytogenes.

Diagramas de Bode representativos sobre el rango de frecuencia de 1 a 100 000 Hz (los recuadros son una vista ampliada del rango de frecuencia inferior de 1 a 5 Hz) para el sensor de cepillo ALG-thiomer/Pt funcionalizado con aptámero de 400 nM expuesto a (a) L monocytogenes en PBS y (b) L. monocytogenes + S. aureus en PBS. (c) Curvas de calibración (cambio de impedancia total a 1 Hz frente a la concentración logarítmica de bacterias). Las barras de error representan la desviación estándar de la media aritmética de al menos tres repeticiones.

Después de confirmar la capacidad del sensor de cepillo ALG-thiomer/Pt para detectar bacterias en PBS, los sensores se probaron en un producto alimenticio para determinar su selectividad a la bacteria objetivo y si la sensibilidad puede verse afectada por la interferencia de los componentes de los alimentos. Se utilizó caldo de pollo (Fig. 6, y = 42.59x + 1320.93, R2 = 0.98) ya que contiene carbohidratos y proteínas, entre otros componentes, que podrían interactuar con el biosensor a través de adsorción no específica dando como resultado una señal falsa positiva. La sensibilidad hacia L. monocytogenes en caldo de pollo fue de 42,59 ± 2,35 Ω/log(UFC mL−1) con LOD de 4,4 ± 0,8 UFC mL−1, ambos similares (p > 0,05) a los resultados en PBS. Estos resultados también indican que el aptámero es capaz de unirse selectivamente a L. monocytogenes incluso en matrices alimentarias complejas. Usando el mismo aptámero, Hills et al.30 informaron un LOD ligeramente mayor de 9.1 CFU mL-1 en caldo de vegetales con un electrodo de cepillo de óxido de grafeno/nanoplatino/quitosano reducido capa por capa que actuaba en función de la respuesta del pH del quitosano.

(a) Diagrama de Bode representativo sobre el rango de frecuencia de 1 a 100 000 Hz (los recuadros son una vista ampliada del rango de frecuencia inferior de 1 a 5 Hz) y (b) curva de calibración (cambio de impedancia total a 1 Hz frente a bacterias logarítmicas concentración) para el sensor de cepillo ALG-tiomero/Pt funcionalizado con aptámero 400 nM expuesto a L. monocytogenes en caldo de pollo. Las barras de error representan la desviación estándar de la media aritmética de al menos tres repeticiones.

La efectividad de la unión del aptámero y su papel en el rendimiento del biosensor se evaluó aún más al exponer el sensor de cepillo ALG-thiomer/Pt sin aptámeros a concentraciones crecientes de L. monocytogenes en PBS (consulte la información de respaldo, Fig. S4). El LOD obtenido fue de 28,88 ± 1,31 UFC mL−1 con una sensibilidad de 23,27 ± 7,87 Ω/log (UFC mL−1), respectivamente. Los rendimientos del sensor con aptámero presentado anteriormente fueron significativamente (p < 0,05) mejores en comparación con el sensor sin aptámero. A pesar de algunas trampas aleatorias de bacterias en los nanocepillos, estos resultados de LOD y sensibilidad demuestran el papel del aptámero de unirse selectivamente a L. monocytogenes y mejorar significativamente el rendimiento del sensor. Además, estos resultados demuestran aún más la eficacia del protocolo de actuación para capturar bacterias aplicando los cepillos ALG-thiomer/Pt, que podrían usarse como un paso inicial para el control de la seguridad alimentaria (es decir, el recuento total de bacterias).

El alginato se está volviendo más popular para aplicaciones de biosensores debido a su biocompatibilidad y grupos funcionales útiles para la encapsulación e inmovilización de agentes de biorreconocimiento como la detección de antibióticos, células tumorales, análisis de sangre, entre otros66,67. Algunos utilizaron bacterias encapsuladas para monitorear la toxicidad del agua68,69, pero aun así, menos informes involucran la detección de bacterias. Por ejemplo, Kikuchi et al.70 utilizaron alginato para encapsular un colorante que es escindido por la enzima b-galactosidasa de E. coli para su detección en la leche materna, reportando un LOD de 102 CFU mL−1 después de 2 a 8 h de incubación.

En la Tabla S1 se presenta una compilación de biosensores actuales para la detección de L. monocytogenes en diferentes muestras de alimentos o tampones (consulte la información de respaldo). Liu et al.71 presentaron buenos resultados detectando L. monocytogenes en un rango de 68 a 68 × 106 CFU mL-1 mediante el uso de nanopartículas magnéticas funcionalizadas con aptámeros (como sondas de preconcentración) y nanopartículas de conversión ascendente funcionalizadas con aptámeros (sondas de señal fluorescente) juntos; sin embargo, el procedimiento incluye una incubación de 1 h más un paso de preconcentración. Sidhu et al.72 propusieron una matriz de microelectrodos interdigitados de platino funcionalizados con el mismo aptámero utilizado en el presente trabajo y reportaron un LOD de 5.39 CFU mL−1 de Listeria spp. en PBS también con detección de 17 min. En otro trabajo, Sidhu et al.32 aplicaron los mismos microelectrodos de matriz interdigitada de platino funcionalizados con aptámeros para un flujo rápido in situ mediante la detección de Listeria spp. en agua de riego usando un potenciostato basado en un teléfono inteligente y en condiciones de flujo y el LOD informado fue de 48 CFU mL−1. Nuestro sensor ofrece algunas ventajas sobre la mayoría que se encuentran en la literatura, incluida una fabricación más simple y rápida sin necesidad de fabricación en sala limpia; no requiere etiquetado ni preconcentración de bacterias; y corto tiempo de detección, siendo una de las plataformas más eficientes para la detección de L. monocytogenes hasta la fecha, con bajo límite de detección y amplio rango de detección lineal relevante para la seguridad alimentaria.

La detección de un patógeno específico en cualquier muestra de alimento real requiere mucho tiempo y es laboriosa, ya que hay señales de fondo debido a las impurezas en la muestra, ya sea por las estructuras complejas de múltiples componentes o por la presencia de otros microorganismos (patógenos y no patógenos) que requieren una detección previa. tratamientos de enriquecimiento y entornos de laboratorio. Este estudio informa sobre aptasensores impedimétricos sensibles, selectivos y fáciles de fabricar utilizando un proceso de fabricación de un solo paso de nanocepillos de tiomero/platino de alginato. Por primera vez, mostramos que ALG-thiomer modificado con nanoplatino y aptámeros mantiene las propiedades de respuesta a estímulos del alginato al mismo tiempo que mantiene la afinidad por la bacteria objetivo, L. monocytogenes, debido a la unión de aptámeros. La actuación de los cepillos ALG-tiomero/Pt mejoró significativamente la detección de bacterias debido al atrapamiento de la matriz en el estado colapsado. El rango de detección lineal entre 10 y 106 CFU mL−1 y el límite de detección de 5 CFU mL−1 en una muestra de alimentos cubren los niveles relevantes para el análisis de seguridad alimentaria, lo que permite a los fabricantes de alimentos reducir las implicaciones económicas y de salud pública de las retiradas de alimentos contaminados. . En comparación con otros métodos disponibles en la literatura, este sensor se encuentra entre los mecanismos de captura más eficientes para L. monocytogenes, además de otras ventajas como la fabricación simple en un solo paso, sin etiquetado, sin necesidad de preincubación ni concentración y una respuesta tiempo de 17 min. Los resultados presentados en este estudio demuestran que la plataforma de sensores desarrollada es adecuada para su uso en aplicaciones de monitoreo de seguridad alimentaria. Además, esta plataforma de ALG-tiomero se puede probar más para la detección de otros patógenos transmitidos por los alimentos o la detección de moléculas pequeñas, lo que mejora considerablemente la detección de objetivos en matrices complejas.

Los datos presentados en este estudio están disponibles previa solicitud a los autores correspondientes.

Somerset, VS Biosensores ambientales (InTech, 2011).

Libro Google Académico

FDA. Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU.: Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins (FDA, 2012).

Google Académico

Hoffmann, S., Maculloch, B. y Batz, M. Carga económica de las principales enfermedades transmitidas por los alimentos adquiridas en los Estados Unidos, EIB-140 (Servicio de Investigación Económica del Departamento de Agricultura de EE. UU., 2015).

Google Académico

USFDA. El registro de alimentos notificables: una descripción general de cinco años de la selección de recursos de inspección y la identificación de patrones de adulteración (Agencia de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos, 2016).

Google Académico

Ramaswamy, V. et al. Listeria: revisión de epidemiología y patogenia. J. Microbiol. inmunol. Infectar. 40, 4–13 (2007).

CAS Google Académico

Frye, DM et al. Un brote de gastroenteritis febril asociado con carnes frías contaminadas con listeria monocytogenes. J. Microbiol. inmunol. Infectar. 90005, 943–949 (2002).

Google Académico

De Noordhout, CM et al. La carga global de la listeriosis: una revisión sistemática y un metanálisis. Lancet Infect Dis. 14, 1073–1082 (2014).

Artículo Google Académico

FDA. Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU.: retiros del mercado, retiros del mercado y alertas de seguridad. (2021). https://www.fda.gov/safety/recalls-market-withdrawals-safety-alerts. Consultado el 10 de febrero de 2021.

Lavecchia, T., Tibuzzi, A. & Giardi, MT Biosensores para análisis y seguridad alimentaria funcional. en Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors, 267–281 (2010).

Velusamy, V., Arshak, K., Korostynska, O., Oliwa, K. y Adley, C. Una descripción general de la detección de patógenos transmitidos por los alimentos: en la perspectiva de los biosensores. Biotecnología. Adv. 28, 232–254 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Hitchins, A., Jinneman, K. & Chen, Y. Manual analítico bacteriológico Capítulo 10: Detección de Listeria monocytogenes en alimentos y muestras ambientales, y enumeración de Listeria monocytogenes en alimentos. (2017).

Vanegas, DC, Claussen, J., Mclamore, E. & Gomes, C. Estrategias de detección de patógenos microbianos. en Enciclopedia de ingeniería agrícola, alimentaria y biológica, 1–4 (CRC Press, 2017). https://doi.org/10.1081/E-EAFE2-120051868.

Vanegas, DC, Gomes, C. & Mclamore, ES Biosensores para el monitoreo indirecto de bacterias transmitidas por alimentos. Biosens. J. 5, 1-3 (2016).

Artículo Google Académico

Baraket, A. et al. Un proceso de fabricación de plataforma de biosensores electroquímicos completamente integrado para la detección de citoquinas. Biosens. Bioelectrón. 93, 170–175 (2017).

Artículo CAS Google Académico

McLamore, ES et al. FEAST de biosensores: tecnologías de detección de alimentos, ambientales y agrícolas (FEAST) en América del Norte. Biosens. Bioelectrón. 178, 113011 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Mclamore, ES et al. SNAPS: soluciones puntuales de análisis de sensores para sistemas de detección y soporte de decisiones. Sensores 19, 4935 (2019).

Artículo ADS CAS Google Académico

Burrs, SL et al. Un estudio comparativo de bionanocompuestos híbridos de grafeno-hidrogel para biodetección. Analista 140, 1466–1476 (2015).

Artículo ADS CAS Google Académico

Yu, H. et al. Avances recientes de las aplicaciones prácticas de los biosensores electroquímicos de platino. Frente. química 9, 677876 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Taguchi, M. et al. PULSED: sonoelectrodeposición pulsada de nanoplatino fractal para mejorar el rendimiento del biosensor amperométrico. Analista 141, 3367–3378 (2016).

Artículo ADS CAS Google Académico

Claussen, JC et al. Nanoestructuración de nanopartículas de platino en nanoláminas de pétalos de grafeno multicapa para biodetección electroquímica. Adv. Función Mate. 22, 3399–3405 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Zeng, R. et al. Eficiencia catalítica mejorada con nanocatalizadores de platino de un solo átomo con arquitecturas supermoleculares de enzima-ADN. Nanoenergía 74, 104931 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Hrapovic, S., Liu, Y., Male, KB & Luong, JHT Plataformas de biodetección electroquímica que utilizan nanopartículas de platino y nanotubos de carbono. Anal. química 76, 1083–1088 (2004).

Artículo CAS Google Académico

Acquah, C., Agyei, D., Monney, I., Pan, S. y Danquah, M. Detección aptamérica en seguridad alimentaria. En control de alimentos y bioseguridad. en Handbook of Food Bioengineering (Vol. 16) (ed. Grumezescu, H. &) 259–277 (Elsevier, 2018).

Teng, J. et al. Tecnologías basadas en aptámeros en la detección de patógenos transmitidos por alimentos. Frente. Microbiol. 7, 1426 (2016).

Artículo Google Académico

Acquah, C. et al. Implementación de tecnología de detección aptamérica para el monitoreo rápido de pandemias. crítico Rev. Biotecnología. 36, 1010–1022 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Tan, SY et al. Modificaciones SELEX y técnicas bioanalíticas para aptámeros: Caracterización de unión a diana. crítico Anal Rev. química 46, 521–537 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Kärkkäinen, RM et al. Aptámeros para el aseguramiento de la seguridad y la calidad en la industria alimentaria: Detección de patógenos. En t. J. ciencia de los alimentos. Tecnología 46, 445–454 (2011).

Artículo Google Académico

Torres-Chavolla, E. & Alocilja, EC Aptasensores para la detección de patógenos microbianos y virales. Biosens. Bioelectrón. 24, 3175–3182 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Ohk, SH, Koo, OK, Sen, T., Yamamoto, CM & Bhunia, AK Biosensor de fibra óptica funcionalizado con anticuerpos y aptámeros para la detección específica de Listeria monocytogenes en los alimentos. Aplicación J. Microbiol. 109, 808–817 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Hills , KD , Oliveira , DA , Cavallaro , ND , Gomes , CL & McLamore , ES Activación de bordes de nanocepillo de quitosano-aptámero para la detección de patógenos . Analista 143, 1650-1661 (2018).

Artículo ADS CAS Google Académico

Oliveira, DA, Althawab, S. & Mclamore, ES Fabricación en un solo paso de cepillos de quitosano-platino que responden a estímulos para la detección de listeria monocytogenes. Biosensores 11, 511 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Sidhu, R. et al. aptasensor plano interdigitado para la detección de flujo continuo de Listeria spp. en medios de cultivo de lechuga hidropónica. Sensores 20, 5773 (2020).

Artículo ADS CAS Google Académico

Hu, L., Zhang, Q., Li, X. & Serpe, MJ Materials Horizons and Actuation. Mate. Horizontes 6, 1774–1793 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Ju, HK, Kim, SY & Lee, YM Comportamientos sensibles al pH/temperatura de hidrogeles de injerto tipo peine y semi-IPN compuestos de alginato y poli(N-isopropilacrilamida). Polímero 42, 6851–6857 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Lopez-Leon, T., Carvalho, ELS, Seijo, B., Ortega-Vinuesa, JL & Bastos-Gonzalez, D. Caracterización fisicoquímica de nanopartículas de quitosano: comportamiento electrocinético y de estabilidad. J. Interfaz coloidal Sci. Rev. 283, 344–351 (2005).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Cheong, M. & Zhitomirsky, I. Electrodeposición de ácido algínico y películas compuestas. Surf de coloides. A. 328, 73–78 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Reddy, KM et al. Microesferas semi-IPN sensibles a la temperatura de alginato de sodio y N-isopropilacrilamida para la liberación controlada de 5-fluorouracilo. Aplicación J. polim. ciencia 107, 2820–2829 (2007).

Artículo Google Académico

Liu, A. et al. Actuador de polipirrol con superficie bioadhesiva para la acumulación de bacterias de medios fisiológicos. Aplicación ACS. Mate. Interfaces 1, 951–955 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Giacobassi, CA et al. Paradigma sentido-análisis-respuesta-actuación (SARA): sistema de prueba de concepto que abarca la actuación a nanoescala y macroescala para la detección de Escherichia coli en medios acuosos. Actuadores 10, 2 (2021).

Artículo Google Académico

Wang, Z. et al. Electrodeposición de recubrimientos compuestos capa por capa de alginato/quitosano sobre sustratos de titanio. Carbohidr. polim. 103, 38–45 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Vigués, N., Pujol-Vila, F., Marquez-Maqueda, A., Muñoz-Berbel, X. & Mas, J. Electro-addressable conductive alginate hydrogel for bacterial trapping and general toxicity determination. Anal. Chim. Acta 1036, 115–120 (2018).

Artículo Google Académico

Chen, X., Yan, H., Sun, W., Shi, Z. y Zhang, W. Electrodeposición de alginato: película compuesta de MnO2–C en el electrodo de líquido iónico de carbono para la electroquímica directa y la electrocatálisis de la mioglobina. polim. Toro. 76, 3971–3987 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Jindal, AB, Wasnik, MN & Nair, HA Síntesis de alginato tiolado y evaluación de la mucoadhesividad, citotoxicidad y propiedades retardantes de la liberación. Indian J.Pharm. ciencia 72, 766–774 (2010).

Artículo CAS Google Académico

termocientífico. Reactivo de Ellman (Thermo Scientific, 2011).

Google Académico

Vanegas, DC et al. Un estudio comparativo de la arquitectura de nanoestructura híbrida de carbono-platino para la biodetección amperométrica. Analista 139, 660–667 (2014).

Artículo ADS CAS Google Académico

termocientífico. Manual técnico de reticulación (Thermo Scientific, 2012).

Google Académico

Marcano, YC & Sabino, MA Modificación química de alginato con L-cisteína para ampliar su uso en sistemas de administración de fármacos. Celúla. química Tecnología 52, 559–567 (2018).

CAS Google Académico

Srinivasan, V., Stiefel, EI, Elsberry, A. & Walton, RA Sulphur 2p desplazamientos químicos asociados con la unión de grupos tiol y tioéter a iones de metales de transición. Mermelada. química Soc. 101, 2611–2614 (1979).

Artículo CAS Google Académico

Moulder, JF, Stickle, WF, Sobol, PE y Bomben, KD Manual de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (Perkin-Elmer Corporation, 1992).

Google Académico

Wang, D., Khan, W., Tang, Z. & Wang, Y. Evaluación de la aplicabilidad de puntos de carbono emisores de color verde brillante en estado sólido para diodos emisores de luz blanca. química Un asiático J. 13, 292–298 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Li, Z., Chang, SC y Williams, RS Autoensamblaje de moléculas de alcanotiol sobre superficies de platino y óxido de platino. Langmuir 19, 6744–6749 (2003).

Artículo CAS Google Académico

termocientífico. Azufre XPS. (2021). https://xpssimplified.com/elements/sulfur.php.

Yang, B. & Agrios, AG Unión de nanopartículas de Pt a una superficie de óxido de metal usando una molécula bifuncional tiol-carboxilo OH OH OH. J. Interfaz coloidal Sci. 513, 464–469 (2018).

Artículo ADS CAS Google Académico

Castner, DG, Hinds, K. & Grainger, DW Espectroscopía de fotoelectrones de rayos X azufre 2p estudio de tiol orgánico y interacciones de unión de disulfuro con superficies de oro. J. Interfaz coloidal Sci. 7463, 5083–5086 (1996).

Google Académico

Kwon, K. et al. Mejora de la estabilidad electroquímica y la actividad catalítica de las nanopartículas de Pt a través de una fuerte interacción metal-soporte con carbono mesoporoso ordenado que contiene azufre. Catal. Hoy 164, 186–189 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Romanchenko, A., Likhatski, M. y Mikhlin, Y. Estudio de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) de los productos formados en minerales de sulfuro tras la interacción con complejos acuosos de cloruro de platino (IV). Catal. Hoy https://doi.org/10.3390/min8120578 (2018).

Artículo Google Académico

Yasin, HM, Denuault, G. & Pletcher, D. Estudios de la electrodeposición de platino metálico a partir de un baño de ácido hexacloroplatínico. J. Electroanal. química 633, 327–332 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Kim, SJ, Yoon, SG, Lee, YH & Kim, SI Comportamiento de flexión de hidrogeles compuestos de poli (ácido metacrílico) y alginato por estímulo eléctrico. polim. En t. 53, 1456–1460 (2004).

Artículo CAS Google Académico

Pasparakis, G. & Bouropoulos, N. Estudios de hinchazón y liberación in vitro de verapamilo a partir de perlas de alginato de calcio y alginato de calcio-quitosano. En t. J. Pharm. 323, 34–42 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Yang, J., Chen, J., Pan, D., Wan, Y. & Wang, Z. Hidrogeles de red interpenetrante sensibles al pH basados en derivados de quitosano y alginato para la administración oral de fármacos. Carbohidr. polim. 92, 719–725 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Briandet, R., Meylheuc, T., Maher, C. y Bellon-Fontaine, MN Listeria monocytogenes Scott A: Carga de la superficie celular, hidrofobicidad y características del donante y aceptor de electrones en diferentes condiciones ambientales de crecimiento. aplicación Reinar. Microbiol. 65, 5328–5333 (1999).

Artículo ADS CAS Google Académico

Malic, L. et al. Chip de microfluidos basado en polímeros para la captura y liberación inmunomagnética rápida y eficiente de Listeria monocytogenes. Ficha de laboratorio 15, 3994 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Lisdat, F. & Schäfer, D. El uso de la espectroscopia de impedancia electroquímica para la biodetección. Anal. Bioanal. química 391, 1555–1567 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Garrote, BL, Santos, A. & Bueno, PR Perspectivas y precauciones para el uso de métodos espectroscópicos eléctricos en aplicaciones de biodetección sin etiquetas. ACS Sens. 4, 2216–2227 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Gaillard, J., Berche, P. y Frehei, C. La entrada de L. monocytogenes en las células está mediada por Internalina, una proteína repetida que recuerda a los antígenos de superficie de los cocos grampositivos. Celda 65, 1127–1141 (1991).

Artículo CAS Google Académico

Lin, Y. et al. Un biosensor de quimioluminiscencia de "señal activada" para la detección de trombina basado en hidrogel de alginato de sodio magnético funcionalizado con ADN y nanohojas de marco metaloorgánico metaloporfirínico.pdf. Talanta 207, 120300 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Zhan, X., Hu, G., Wagberg, T., Zhan, S. & Xu, H. Aptasensor electroquímico para tetraciclina utilizando un electrodo de carbono serigrafiado modificado con una película de alginato que contiene nanopartículas de magnetita (Fe3O4) y óxido de grafeno reducido . Microchim. Acta 183, 723–729 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Wasito, H., Fatoni, A., Hermawan, D. & Sutji, S. Ecotoxicología y biosensor bacteriano inmovilizado de seguridad ambiental para el monitoreo rápido y efectivo de la toxicidad aguda en el agua. ecotoxicol. Reinar. seguro 170, 205–209 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Jung, I., Seo, B., Lee, J., Kim, C. & Bock, M. Un biosensor tipo tira reactiva que utiliza bacterias bioluminiscentes encapsuladas en microesferas de alginato codificadas por colores para la detección de la toxicidad del agua†. Analista 139, 4696–4701 (2014).

Artículo ADS CAS Google Académico

Kikuchi, N. et al. Sensor a base de alginato para la detección de Escherichia coli en leche materna humana. Sostenible 1, 1–15 (2020).

Google Académico

Liu, R. et al. Desarrollo de un aptasensor de fluorescencia para la detección rápida y sensible de Listeria monocytogenes en alimentos. Control de Alimentos 122, 107808 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Sidhu, R. et al. Biosensor de impedancia para la detección rápida de Listeria spp. basado en una matriz de microelectrodos interdigitados de Pt funcionalizados con aptámero. SPIE 9863, 98630 (2016).

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Departamento de Ingeniería Biológica y Agrícola, Universidad Texas A&M, College Station, TX, 77843, EE. UU.

Daniela A. Oliveira

Ciencias Agrícolas, Universidad de Clemson, Clemson, SC, 29631, EE. UU.

Eric S. McLamore

Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad Estatal de Iowa, Ames, IA, 50011, EE. UU.

Carmen L. Gomes

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Correspondencia a Carmen L. Gomes.

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Oliveira, DA, McLamore, ES & Gomes, CL Detección rápida y sin etiquetas de Listeria monocytogenes basada en nanocepillos de alginato-tiomero de platino que responden a estímulos. Informe científico 12, 21413 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25753-7

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Recibido: 13 mayo 2022

Aceptado: 05 diciembre 2022

Publicado: 10 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25753-7

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