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Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 14011 (2022) Citar este artículo

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La estimulación cerebral profunda (DBS) del núcleo subtalámico (STN) se ha convertido en un tratamiento estándar para la enfermedad de Parkinson (EP). Sin embargo, en un número considerable de pacientes se producen efectos secundarios psiquiátricos debilitantes. Investigaciones recientes han revelado que los estímulos externos pueden alterar la homeostasis de los neurotransmisores en las neuronas, lo que se conoce como "reespecificación de neurotransmisores". Aquí, abordamos si la reespecificación de neurotransmisores podría ser un mecanismo por el cual DBS suprime la función serotoninérgica en el núcleo del rafe dorsal (DRN) que conduce a cambios de humor. Infundimos ratones transgénicos 5-HT-Cre (ePET-Cre) con virus AAV para lograr la expresión específica de eYFP y el indicador de calcio codificado genéticamente GCaMP6s en el DRN antes de la metil-4fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP ) tratamiento. Los ratones recibieron electrodos DBS bilaterales en el STN y una fibra óptica en el DRN para fotometría de calcio. Los ratones tratados con MPTP demostraron un fenotipo de EP histológico y de comportamiento, mientras que todos los animales con STN-DBS exhibieron un mayor tiempo de inmovilidad en la prueba de natación forzada, una actividad de calcio reducida y pérdida de la expresión de triptófano hidroxilasa-2 en la DRN. Dado el papel destacado de los transitorios de calcio en la mediación de la reespecificación de neurotransmisores, estos resultados sugieren una pérdida del fenotipo serotoninérgico en la DRN después de STN-DBS. Estos hallazgos indican que la pérdida del fenotipo de células serotoninérgicas puede ser la base de los síntomas depresivos no deseados que siguen a STN-DBS.

La estimulación cerebral profunda (DBS) se ha convertido en un tratamiento neuroquirúrgico exitoso para tratar trastornos neurológicos y psiquiátricos seleccionados1,2,3,4. Se ha demostrado que la DBS del núcleo subtalámico (STN) mejora de forma eficaz los síntomas motores de la enfermedad de Parkinson (EP) intratables médicamente5,6,7,8. A pesar de la mejora a largo plazo de la función motora, algunos pacientes con EP presentan trastornos del estado de ánimo como depresión, ideación suicida e impulsividad después de la cirugía9,10.

Nuestros estudios anteriores han demostrado que la STN-DBS bilateral aguda inhibe la neurotransmisión del sistema de serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT) del mesencéfalo en el núcleo dorsal del rafe (DRN), que es la fuente principal de 5-HT en el sistema nervioso central. y su disfunción se ha asociado con la aparición de trastornos del estado de ánimo11. La STN-DBS aguda en estudios experimentales con animales demostró una tasa de activación reducida de las neuronas DRN 5-HT, una menor liberación de 5-HT en el cerebro anterior y la inducción de un comportamiento de tipo depresivo en ratas con EP12,13. Sin embargo, en entornos clínicos, STN-DBS se aplica de forma crónica. La modulación a largo plazo de las redes neuronales puede inducir cambios permanentes y neuroplásticos14. Más recientemente, se ha demostrado que la identidad de los neurotransmisores en el cerebro maduro puede verse influenciada por estímulos ambientales15. El cambio, la inducción o la eliminación de neurotransmisores asociados con la salida conductual alterada se denominan reespecificación de neurotransmisores16,17,18. Presumimos que la reespecificación de neurotransmisores juega un papel en STN-DBS y ocurre en el sistema DRN 5-HT. Para investigar esto, utilizamos la línea de ratones transgénicos que expresan Cre bajo el potenciador del factor de transcripción Pet1 (ePET-Cre), que permite el direccionamiento selectivo de las neuronas DRN 5-HT19. Estos ratones transgénicos con síntomas asociados a la EP después de la administración de metil-4fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) fueron tratados con STN-DBS diariamente durante un período de tiempo relativamente largo en comparación con los estudios existentes. Se utilizaron evaluaciones conductuales, fotométricas e inmunohistoquímicas para evaluar aspectos de la reespecificación de neurotransmisores en el sistema DRN 5-HT.

Los electrodos estimulantes se colocaron de forma bilateral y simétrica (variación entre electrodos < 0,1 mm) en el STN en todos los ratones excepto dos, para los que los electrodos se ubicaron en la zona incerta. Esos ratones fueron excluidos del análisis. En el material complementario (Fig. S1A-B) se muestra un ejemplo de la trayectoria de los electrodos en una sección coronal del cerebro y la ubicación de todas las puntas de los electrodos en el mapa STN. Se colocaron sondas de fotometría de fibra en el segmento dorsomedial del DRN en todos los ratones excepto en tres, que se excluyeron del procesamiento de señales. No se observaron signos de daño histológico significativo debido a la implantación oa la estimulación eléctrica.

Los ratones tratados con MPTP mostraron un fenotipo motor similar al de la EP en comparación con el grupo tratado con NaCl. El tratamiento con MPTP indujo importantes alteraciones estáticas y dinámicas de la marcha con una velocidad media reducida [MPTP-simulado: 18,09 ± 0,62; estimulación MPTP: 23,91 ± 0,68; NaCl-sham: 22,90 ± 0,80 y NaCl-stim: 22,60 ± 1,17; ANOVA de dos vías; efecto de grupo: F(3,52) = 9,04, p < 0,001; enfermedad*efecto de grupo: F(1,52) = 3,64, p < 0,001; seguido de la comparación por pares de Bonferroni; MPTP-simulado frente a NaCl-simulado: p < 0,001; Fig. 1A], posición dual terminal aumentada [MPTP-sham: 0,021 ± 0,002; estimulación con MPTP: 0,009 ± 0,001 simulación con NaCl: 0,011 ± 0,001 y estimulación con NaCl: 0,015 ± 0,002; ANOVA de dos vías; efecto de grupo: F(3,52) = 10,36, p < 0,001; enfermedad*efecto de grupo: F(1,52) = 2,90, p = 0,160; seguido de la comparación por pares de Bonferroni; MPTP-simulado frente a NaCl-simulado: p < 0,001; Fig. 1B], ciclo de pasos [MPTP-sham: 0,31 ± 0,008, MPTP-stim: 0,24 ± 0,007; simulación con NaCl: 0,25 ± 0,006 y estimulación con NaCl: 0,26 ± 0,008; ANOVA de dos vías; efecto de grupo: F(3,52) = 15,28, p < 0,001; enfermedad*efecto de grupo: F(1,52) = 8,30, p < 0,01; seguido de la comparación por pares de Bonferroni; MPTP-simulado frente a NaCl-simulado: p < 0,001; Fig. 1C] y postura [MPTP-sham: 0,17 ± 0,005, MPTP-stim: 0,12 ± 0,004; simulación con NaCl: 0,13 ± 0,004 y estimulación con NaCl: 0,14 ± 0,004; ANOVA de dos vías; efecto de grupo: F(3,52) = 23,08, p < 0,001, enfermedad*efecto de grupo: F(1,52) = 8,17, p < 0,001; seguido de la comparación por pares de Bonferroni; MPTP-simulado frente a NaCl-simulado: p < 0,01; Figura 1D].

Efecto del tratamiento con MPTP y STN-DBS intermitente en los parámetros dinámicos y estáticos de la marcha de Catwalk. (A–D) Los gráficos muestran una reducción significativa en la velocidad y aumentos del ciclo de pasos, la postura dual terminal y la postura en ratones falsos MPTP. STN-DBS restauró esos parámetros a los niveles de control, lo que se indica por diferencias no significativas entre los grupos MPTP-stim y NaCl-sham, y diferencias significativas entre los grupos MPTP-stim y MPTP-sham. (E) El gráfico muestra una reducción significativa de células TH positivas en la SNc de ratones tratados con MPTP en comparación con los animales tratados con NaCl. (F–G) Microfotografía de bajo aumento representativa de secciones coronales del cerebro que contienen SNc y VTA, teñidas para TH, muestran una pérdida notable de células TH en ratones tratados con MPTP frente a NaCl. Los datos se presentan como media +/− SEM; la diferencia significativa (P < 0,05) se indica mediante un "*", barra de escala = 250 µm. tirosina hidroxilasa, TH; sustancia negra pars-compacta, SNc; área tegmentaria ventral, VTA; núcleo subtalámico, STN; metil-4fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina, MPTP; estimulación cerebral profunda, DBS.

Además, STN-DBS restauró estos parámetros de la marcha en ratones tratados con MPTP con un aumento significativo en la velocidad promedio y una disminución en la postura dual terminal, el ciclo de pasos y la postura [ANOVA bidireccional; efectos de grupo: F(3,52) = 9,04, p < 0,001; F(3,52) = 10,36, p < 0,001; F(3,52) = 15,28, p < 0,001; y F(3,52) = 23,08, p < 0,001, respectivamente; efectos de estímulo*grupo: F(1,52) = 9,07, p = 0,064; F(1,52) = 4,75, p < 0,05; F(1,52) = 12,02, p < 0,01 y F(1,52) = 17,95, p < 0,01, respectivamente]. La comparación por pares post-hoc de Bonferroni de las medias mostró diferencias significativas entre MPTP-sham vs MPTP-stim en todas las pruebas (p < 0.001; Fig. 1A-D). Además, la estimulación no alteró los parámetros de la marcha en ratones tratados con NaCl (NaCl-simulado frente a NaCl-estimulado) en ninguna de las pruebas (comparación por pares post-hoc de Bonferroni: p > 0,05). La inmunohistoquímica de TH post mortem reveló una pérdida significativa (promedio del 60 %) de neuronas dopaminérgicas SNc después de la administración de MPTP en comparación con el tratamiento con NaCl (MPTP-simulado: 198,8 ± 30,54 frente a NaCl-simulado: 491,8 ± 43,82; prueba T de muestras independientes p < 0,005 (fig. 1E-G).

La fotometría de fibra que evalúa los transitorios de calcio de las neuronas DRN mostró una reducción significativa de la fluorescencia de GCaMP6, lo que indica una inhibición neuronal sobre STN-DBS (Fig. 2A-D). La prueba de permutación mostró una disminución de la señalización de calcio por STN-DBS en ratones tratados con MPTP y NaCl (p < 0,05). Después de detener la estimulación, la señal de fluorescencia de GcaMP6 volvió a la línea base en noventa segundos.

Efecto de STN-DBS sobre el sistema serotoninérgico. El efecto de STN-DBS sobre la actividad de las neuronas 5-HT en el DRN medido con sensor de calcio codificado genéticamente GCaMP6s (fotometría de fibra). (A) y (C) ejemplos de mapas de calor del cambio en la fluorescencia (dF/F) antes, durante (el período de estimulación se indica mediante líneas verticales) y después de DBS en ratones tratados con MPTP y NaCl, respectivamente. Cada fila representa una sesión de DBS (un total de 10 ensayos). La escala de colores a la derecha indica dF/F (amarillo = alto y azul oscuro = bajo dF/F). (B) y (D) los gráficos inferiores muestran los cambios acumulativos en la fluorescencia promediados durante los diez ensayos en ratones tratados con MPTP (n = 14) y NaCl (n = 17). La línea negra gruesa indica la media, las áreas sombreadas indican SEM y los segmentos rojos indican una disminución estadísticamente significativa desde el inicio (el período de DBS se indica mediante líneas discontinuas verticales; p < 0,05; prueba de permutación). (E) STN-DBS indujo un comportamiento depresivo similar en la prueba de nado forzado, mostrado por un mayor tiempo de inmovilidad en animales estimulados. (F) El gráfico muestra que STN-DBS crónico redujo significativamente la expresión de TPH2 en células transfectadas (que expresan eYFP) en ratones tratados con MPTP y NaCl. (G), (H) fotomicrografías representativas de secciones coronales del cerebro que contienen las células que expresan eYFP de visualización DRN (verde) que se etiquetaron dos veces con anticuerpos producidos contra TPH2 (rojo; barra de escala = 150 μm). Los recuadros en (G, H) muestran una mayor ampliación de las células eYFP que con y sin etiquetado TPH2 (barra de escala = 50 μm). Los datos se presentan como media +/− SEM; la diferencia significativa (P < 0,05) se indica con un "*". Núcleo subtalámico, STN, núcleo del rafe dorsal, DRN, proteína fluorescente amarilla potenciada, eYFP; triptófano hidroxilasa-2, TPH2; metil-4fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina, MPTP; estimulación cerebral profunda, DBS.

La prueba FST se suspendió debido al riesgo de ahogamiento. Como resultado, no fue posible comparar cuatro grupos con una prueba ANOVA debido al bajo tamaño de la muestra. En cambio, los datos de los animales estimulados (NaCl-stim y MPTP-stim) se agruparon en comparación con los animales simulados (NaCl-sham y MPTP-sham) (estimulación: 139,56 ± 14,39 frente a simulación: 88,93 ± 15,13; prueba T de muestras independientes , p < 0,05 (fig. 2E). STN-DBS indujo desesperación conductual en el FST, que fue evidente por el aumento del tiempo de inmovilidad en comparación con los ratones no estimulados. Este comportamiento similar a la depresión después de STN-DBS se observó tanto en ratones tratados con MPTP como con NaCl.

Después de que establecimos que STN-DBS indujo un comportamiento depresivo y disminuyó la señalización de calcio en el DRN, evaluamos posteriormente el fenotipo de las neuronas DRN 5-HT dirigidas genéticamente. Los recuentos de células estereológicas de proteínas fluorescentes amarillas mejoradas (eYFP)/triptófano hidroxilasa-2 (TPH2) doblemente marcadas que expresan neuronas en el DRN mostraron un aumento significativo de neuronas positivas para eYFP/negativas para TPH2 en ratones tratados con STN-DBS en comparación con animales estimulados de forma simulada [MPTP y NaCl-stim: 1670 ± 144 y 1590 ± 141, vs MPTP y NaCl-sham: 712 ± 50 y 518 ± 83, respectivamente; ANOVA de dos vías; efecto de grupo: F(3,14) = 27,60, p < 0,001; enfermedad*efecto de grupo: F(1,14) = 1,48, p = 0,24; y efecto del grupo estimulante*: F(1,14) = 81,08, p < 0,001; Fig. 2F-H]. Se encontró que este efecto inhibidor de la STN-DBS crónica en la expresión de TPH2 era independiente de la integridad de la vía de la dopamina nigroestriatal, ya que esta observación estaba presente tanto en ratones tratados con MPTP como con NaCl cuando se probó mediante la comparación post-hoc por pares de las medias de Bonferroni [ MPTP-simulado frente a MPTP-estimulado: p < 0,001; NaCl-simulado frente a NaCl-estimulación: p < 0,001; MPTP-simulado frente a NaCl-simulado: p = 1,00 y MPTP-estimulado frente a NaCl-estimulado: p = 1,00; Figura 2F]. Además, ni la administración de STN-DBS ni de MPTP alteró la expresión neuronal de c-Fos en el DRN, y no se encontraron cambios significativos entre los grupos [ANOVA de dos vías; efecto de grupo: F(3,18) = 0,31, p = 0,81; Figura S3]. Finalmente, la cuantificación de células que expresan TPH2 y eYFP en el DRN no reveló ninguna diferencia significativa entre los grupos [ANOVA bidireccional; efectos de grupo: (F(3,14) = 0,40, p = 0,76; y F(3,14) = 1,73, p = 0,21, respectivamente; Fig. S4).

En este estudio, investigamos los efectos neuroplásticos de DBS en el fenotipo del neurotransmisor. Recientemente, se describió la reespecificación de neurotransmisores en el cerebro adulto en el que señales externas inducían el cambio de fenotipo de neurotransmisores, la inducción o eliminación de neurotransmisores con alteraciones conductuales concurrentes16,17,18. Presumimos que este fenómeno podría desempeñar un papel en DBS. Esto puede ser particularmente relevante para STN-DBS como un tratamiento neuroquirúrgico ampliamente aceptado en la EP médicamente refractaria con cambios de comportamiento motores y no motores dependientes de la estimulación5,6,7,8. Los pacientes pueden experimentar síntomas depresivos después de la cirugía, lo que en sí mismo es un factor de riesgo para el suicidio postoperatorio9,10. Comprender los mecanismos neuronales de estos cambios de comportamiento es relevante para los más de 208.000 pacientes que ya reciben tratamiento con DBS en todo el mundo20.

Utilizamos la línea de ratón ePET-Cre, que permite una evaluación específica de las neuronas 5-HT en el DRN que sintetiza TPH19. La administración de MPTP en estos ratones resultó en una pérdida significativa (aproximadamente 60%; Fig. 1E) de neuronas de dopamina SNc y mostró alteraciones de la marcha que fueron aliviadas por STN-DBS, imitando en general la degeneración dopaminérgica y los efectos motores beneficiosos de la estimulación en pacientes con EP (Fig. .1A–D).

Además, STN-DBS provocó desesperación conductual en ratones MPTP, lo que se considera que refleja un comportamiento depresivo (Fig. 2E). Este cambio de comportamiento por STN-DBS fue independiente de la integridad de la vía nigroestriatal y la función motora, ya que los ratones tratados con NaCl mostraron un comportamiento similar (Fig. S2). Esta observación también fue reportada por nuestros estudios previos12,21. El pretratamiento con el inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina citalopram antes de STN-DBS fue eficaz para prevenir la desesperación conductual12. Esto señaló un mecanismo dependiente de 5-HT y desencadenó experimentos que investigaron los efectos posteriores de STN-DBS en el sistema 5-HT del tronco encefálico, con el DRN como la principal fuente de inervación de 5-HT en el cerebro anterior11.

Usando mediciones fotométricas de fibra de la señalización de calcio, demostramos en este estudio que STN-DBS intermitente disminuyó la señalización de calcio y causó inhibición neuronal dentro del DRN (Fig. 2A-D). Esto está en consonancia con los experimentos electrofisiológicos agudos de STN-DBS en los que la estimulación disminuyó la tasa de activación neuronal de 5-HT en 40-50 en registros de células individuales extracelulares12,22. Experimentos posteriores de microdiálisis in vivo también encontraron una disminución de la liberación de 5-HT en las regiones terminales del prosencéfalo, como se esperaba13,23. Estudios anteriores se han centrado en el circuito neuronal subyacente. Dado que faltan neuronas que proyecten STN al DRN, se ha postulado que la inhibición de la neurotransmisión 5-HT está mediada por una red neuronal multisináptica. La habénula lateral puede contribuir a esta red como una estructura de entrada inhibidora principal bien definida para la DRN y se le ha atribuido un papel fundamental en los mecanismos de retroalimentación de 5-HT21,22. Aunque STN recibe entradas de 5-HT del DRN, no hay evidencia sobre el efecto directo de STN-DBS en las células 5-HT a través de estas entradas. Los estudios electrofisiológicos han demostrado que STN-DBS no indujo respuestas ortodrómicas antidrómicas o de latencia corta (< 10 ms) en histogramas de tiempo periestímulo registrados desde el DRN12. También encontramos que STN-DBS aumentó la actividad neuronal con la expresión de c-Fos en las alas laterales del DRN, que reciben información importante de varias regiones del cerebro anterior, incluida la habénula lateral21. Sin embargo, otros mecanismos, como la inhibición mediada por el receptor 5-HT o los cambios en los microcircuitos DRN, no se pueden descartar por completo y pueden contribuir a nuestras observaciones. Se ha demostrado que la STN-DBS aguda altera las tasas de disparo neuronal de las neuronas habenulares que se proyectan al DRN22. Queda por determinar cómo STN-DBS influye en la neurotransmisión y la homeostasis de 5-HT. Sin embargo, se ha demostrado que algunas células recuperan la capacidad de disparar picos intrínsecos de potencial de acción en presencia de estimulación continua24, mientras que otras neuronas permanecen inhibidas después del cese de la estimulación22. Es muy probable que estas actividades alteradas influyan en los estrictos mecanismos de retroalimentación de 5-HT y pueden desencadenar neuroplasticidad dentro de la red.

Nuestro estudio anterior indicó que la DBS del núcleo anterior del tálamo aumentó el número de neuronas dopaminérgicas en el área tegmental ventral25. Esto podría haber sido indicativo de la reespecificación del neurotransmisor inducida por DBS. En el estudio actual, las neuronas positivas para eYFP en el DRN normalmente deberían expresar TPH2 en la gran mayoría (> 90 %)19. Curiosamente, encontramos que STN-DBS reduce la cantidad de neuronas positivas eYFP / TPH2 doblemente marcadas cuantificadas mediante métodos estereológicos (Fig. 2F-H). Aunque ePET-Cre se dirige genéticamente específicamente a las neuronas DRN 5-HT, debe tenerse en cuenta que representa una parte de la población total de 5-HT19. Además, en este estudio se transfectaron células 5-HT solo alrededor del sitio de infusión. La cuantificación estereológica de células que expresan eYFP y TPH2 en el DRN no reveló diferencias significativas entre los grupos (Fig. S4). Además, la expresión de c-Fos en DRN no se vio alterada por STN-DBS, lo que sugiere que la actividad neuronal general después de la estimulación intermitente se mantuvo estable (Fig. S3).

Los transitorios de calcio intracelular dependientes de la actividad juegan un papel clave en la reespecificación de neurotransmisores al regular la fosforilación de factores de transcripción que son críticos para definir el fenotipo de neurotransmisores de las células17,26,27. Sin embargo, la forma en que los transitorios de calcio alteran la reespecificación de los neurotransmisores parece diferir entre los sistemas de transmisores y las especies. Por ejemplo, se demostró que la actividad elevada de las neuronas dopaminérgicas en el núcleo paraventricular del hipotálamo en ratas adultas es necesaria para la pérdida de la expresión de dopamina después de la exposición al fotoperíodo de un día largo18. Mientras que las disminuciones en los picos de calcio por la exposición de Xenopus laevis a la oscuridad conducen a la pérdida de la expresión de dopamina en el hipotálamo28. Aparentemente, los transitorios de calcio alterados podrían provocar efectos opuestos en las neuronas serotoninérgicas. La supresión de la actividad en el cerebro posterior de Xenopus laevis generó un aumento en el número de neuronas que expresan TPH en el núcleo del rafe. Mientras que la mejora de la actividad condujo al resultado opuesto27. En nuestro estudio, una disminución en el número de neuronas que expresan TPH2 se asoció con transitorios reducidos de Ca2+. Esto contrasta con la reespecificación de células dopaminérgicas en ratas18, en las que un aumento en la actividad de Ca2+ se correlacionó con la pérdida del fenotipo de células dopaminérgicas. Cabe señalar que en este estudio no se cuantificó la medida en que las células 5-HT se transfectaron con el virus GCaMP6s. Por lo tanto, es plausible que los transitorios de Ca2+ no se midieron en todas las células serotoninérgicas.

Las teorías iniciales sugirieron que DBS en los entornos de estimulación comúnmente utilizados en la práctica clínica disminuye el disparo espontáneo de las poblaciones neuronales e impulsa las proyecciones axonales cerca del electrodo, también conocido como "modelo de tasa de disparo", que se basó en los efectos locales y en tiempo real de DBS14. Hoy en día, amplia evidencia muestra que los cambios en la actividad neuronal per se son estados insostenibles, y las neuronas recuperan su actividad intrínseca con el tiempo24 y la estimulación eléctrica produce efectos prolongados asociados con la plasticidad incluso cuando la estimulación está desactivada29. De manera similar, los cambios transitorios en la actividad de Ca2+ podrían conducir a la reespecificación del transmisor, lo que puede tener una red y efectos bioquímicos que trascienden el tiempo de estimulación. En conjunto, estos datos de comportamiento, fotométricos e inmunohistoquímicos señalan un papel clave para la pérdida del fenotipo de células 5-HT derivada del estímulo. Argumentamos que esta pérdida del fenotipo 5-HT juega un papel clave en los síntomas depresivos no deseados después de STN-DBS. El desvanecimiento del fenotipo 5-HT también podría ser el mecanismo por el cual STN-DBS reduce la discinesia tardía resistente al tratamiento. El sistema 5-HT se ha implicado en los síntomas de la discinesia. La extensa inervación de 5-HT de los ganglios basales modula la neurotransmisión de dopamina30,31. La menor incidencia de discinesia se asocia con el antagonismo del receptor 5-HT232,33. Además, los síntomas de discinesia pueden verse exacerbados por el tratamiento concomitante con inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina34,35,36. Según nuestra observación de que STN-DBS suprime el fenotipo de las células 5-HT, se puede concluir que la reducción de la función 5-HT de los ganglios basales es un componente clave del mecanismo terapéutico de DBS en la discinesia.

En conclusión, la comprensión de los efectos neuroplásticos es fundamental para nuestra comprensión de la modulación de la red por DBS y la reducción de los síntomas o los efectos secundarios. Este estudio revela evidencia de que STN-DBS induce cambios en la señalización de calcio en el sistema 5-HT de los núcleos del rafe del cerebro medio y da como resultado la reespecificación de neurotransmisores, lo que puede desempeñar un papel en los efectos secundarios psiquiátricos en la EP. La pérdida del fenotipo de células 5-HT también podría ser el mecanismo por el cual STN-DBS reduce la discinesia tardía resistente al tratamiento.

Los experimentos se realizaron en 56 ratones ePET-Cre transgénicos macho (stock JAX; n.º 012.712). Los animales se alojaron socialmente a temperatura y humedad constantes y ciclos inversos de luz/oscuridad (12 h cada uno) con libre acceso a comida y agua. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas de "Investigación con animales: Informe de experimentos in vivo (ARRIVE)". Los procedimientos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales de la Universidad de Maastricht de acuerdo con la Autoridad Central para Procedimientos Científicos en Animales (CCD; protocolo # AVD107002016543).

Los ratones se asignaron aleatoriamente a uno de los siguientes cuatro grupos: NaCl-simulado, NaCl-STN-DBS, MPTP-simulado o MPTP-STN-DBS. A los ratones se les inyectó MPTP (30 mg/kg ip) o NaCl (0,9 % ip) durante cinco días consecutivos, dos semanas antes de la cirugía estereotáctica. La cirugía estereotáctica37 se realizó bajo anestesia inhalatoria con isoflurano (Abbott Laboratories; inducción 4%, mantenimiento 1,5-2%) tras pretratamiento analgésico (buprenorfina, 0,1 mg/Kg sc). La cabeza del ratón se colocó y fijó en un marco estereotáxico (Stoelting). Se mantuvo una temperatura corporal de 37 °C con una almohadilla termorreguladora. Después de la anestesia local (lidocaína 1% sc), se expuso el cráneo y se hicieron agujeros de trepanación para la implantación de electrodos STN bilaterales (coordenadas de bregma basadas en atlas de cerebro de ratón: AP − 2,00 mm, ML ± 1,50 mm, DV − 4,55 mm 38 ) y se implantó una sonda de fotometría de fibra (400 μm; 0.48NA Patchcord) en el DRN (coordenadas de bregma basadas en atlas de cerebro de ratón: AP − 4.5, ML − 0.25, DV-2.9 en un ángulo de 32° desde la izquierda).

Durante la misma cirugía y antes de que tuviera lugar la implantación, se inyectaron dos vectores virales en el DRN. Se inyectó un virus adenoasociado dependiente de Cre que codifica para eYFP (AAV5.EF1a.DIO.eYFP.WPRE.hGH; Penn Vector Core, EE. UU.) (1,0 µl, a una velocidad de 0,1 µl/min) en el DRN. Además, también se inyectó en las mismas coordenadas (500 nL; Nanoject I; Drummond Scientific ).

Después de 2 semanas de recuperación, se realizó STN-DBS durante 10 semanas con sesiones de estimulación de 20 min (5 veces por semana) con estimulación monofásica de alta frecuencia a 130 Hz, un ancho de pulso de 60 μs y una intensidad de corriente de 80 μA. Los animales estimulados simuladamente se conectaron pero se omitió la estimulación. La construcción DBS constaba de dos electrodos concéntricos bipolares recubiertos de oro, con una distancia entre electrodos de 3,0 mm y 5,5 mm de longitud cada uno. Las partes exteriores de acero inoxidable y las interiores de platino-iridio funcionan como polos positivo y negativo, respectivamente. El diámetro exterior de la aguja concéntrica es de 300 μm (incluido el aislamiento), la superficie del electrodo es de 0,021 mm2 y la distancia entre el ánodo y el cátodo es de 50 μm37. La superficie del electrodo es de 0,021 mm2, por lo que los parámetros elegidos dieron como resultado una densidad de carga de 22,9 μC/cm2, muy por debajo del límite de 30 μC/cm2 basado en el modelo de daño neuronal de Shannon39.

Los transitorios de Ca2+ de las neuronas DRN se midieron en ratones tratados con MPTP y solución salina usando una técnica de fotometría de fibra establecida37. Este método permitió medir la fluorescencia dependiente de Ca2+ a granel de GCaMP6 durante STN-DBS. Se utilizó un sistema de fotometría de fibra GCaMP de dos longitudes de onda (Doric Lenses Inc., Quebec, Canadá) para registrar la señal de calcio. Las señales fluorescentes independientes de GCaMP y Ca2+ se excitaron alternativamente mediante un LED de 470 nm y un LED de 405 nm (señal de referencia isosbéstica), respectivamente. Las emisiones de fluorescencia de GCaMP6 se capturaron con un módulo fotorreceptor de femtovatios Newport 2151 y las señales se transmitieron a una unidad de adquisición de datos basada en Field Programmable Gate Array (FPGA) que se integra con el software Doric Neuroscience Studio. Durante el experimento de fotometría, los ratones podían moverse libremente en su jaula. STN-DBS se aplicó de forma intermitente (2 min encendido - 3 min apagado) durante diez ensayos (5 min por ensayo) durante los cuales se realizaron mediciones de fotometría en las fases de encendido/apagado de DBS. Extrajimos, procesamos y analizamos los transitorios de calcio con un script personalizado de MATLAB (Mathworks). Los primeros 2,5 min de los datos durante el período de habituación se descartaron para eliminar el blanqueo rápido inicial de la señal fluorescente. A continuación, la frecuencia de muestreo original de 100 Hz se redujo a 1 Hz y se filtró de paso bajo. Se ajustó un modelo exponencial de dos términos y se restó de los datos diezmados para tener en cuenta los artefactos de blanqueo lento. Luego, se calculó un único valor de fluorescencia de referencia (F0) promediando las señales fluorescentes durante el período de tiempo de 60 s previo a la DBS. Posteriormente, el cambio normalizado en la fluorescencia (dF/F) se calculó como F − F0/F0. Los datos se presentan como un gráfico promedio con SEM. Se utilizó una prueba de permutación para analizar la significación estadística del cambio fluorescente relacionado con DBS40. Para comparar los valores de dF/F en cada momento con el cambio fluorescente relacionado con DBS, se usaron 10 000 permutaciones. Se consideró significativo un nivel α de ≤ 0,05.

Los efectos motores relacionados con MPTP y STN-DBS se evaluaron mediante una configuración de análisis de la marcha computarizada (CatWalkXT; Noldus). Los ratones corrieron por un corredor cerrado con un piso de vidrio duro. Las huellas se registraron con una cámara de alta velocidad a partir de la cual se analizaron los parámetros de movimiento relacionados con la marcha, incluida la velocidad promedio, el ciclo de pasos, la postura dual terminal y la postura. Se usaron cinco carreras rectas ininterrumpidas consecutivas de cada ratón para el análisis estadístico41.

La prueba de nado forzado (FST) se utilizó para evaluar el comportamiento de desesperación en base a un protocolo publicado42. Los ratones se colocaron en un recipiente cilíndrico de plástico ineludible (alto 40 cm × diámetro 19 cm) lleno de agua a 23–25 °C (30 cm de profundidad). La duración de la inmovilidad se registró durante una prueba de 6 min. La inmovilidad se definió como el tiempo de no moverse o con ligeros movimientos para mantener el morro sobre la superficie del agua.

Al final de los experimentos, los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital y se perfundieron transcardiacamente con tampón tyrode, seguido de fijador de paraformaldehído al 4% enfriado con hielo en tampón de fosfato 0,1 M. Los cerebros se extrajeron, se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante la noche y se sumergieron en sacarosa al 20 % durante 24 horas a 5 °C. Los cerebros se seccionaron en cortes coronales (grosor: 22 µm) en un criostato y se almacenaron a -80 °C. Se realizó una tinción estándar con hematoxilina-eosina para evaluar la ubicación de la punta del electrodo (Fig. S1 A). Los animales con electrodos mal colocados fueron excluidos del análisis histológico y de comportamiento.

El agotamiento de dopamina inducido por MPTP se evaluó mediante inmunohistoquímica de tirosina hidroxilasa (TH). Las secciones que contenían la SNc se incubaron durante la noche con un anticuerpo primario producido contra TH (anticuerpo anti-TH policlonal de conejo; Santa Cruz Biotechnology Inc; 1:1000). Al día siguiente, las secciones se incubaron con un anticuerpo secundario (burro anti-conejo alexa 647, Jackson Immunoresearch Laboratories; 1:400) durante una hora. Posteriormente, las secciones se montaron y se cubrieron con cubreobjetos (Immu-Mount, EE. UU.). Se tomaron fotografías de dos niveles anatómicos de bregma (coordinados en base al atlas de cerebro de ratón AP - 2.92 y - 3.16 38) con una cámara digital Olympus DP70 conectada a un microscopio Olympus BX50. Se realizó un recuento semicuantitativo de células TH utilizando el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, EE. UU.).

Para evaluar la actividad neuronal global de la DRN, se evaluó la expresión inmunohistoquímica de c-Fos. Las secciones de DRN se incubaron durante la noche con un anticuerpo anti-c-Fos primario (anti-c-Fos policlonal de conejo; Abcam; 1:1000). A esto le siguió una incubación durante una hora con un anticuerpo secundario (burro anti-conejo alexa 594, Jackson immunoresearch Laboratory; 1:200). Se seleccionaron ocho cortes de bregma - 4,16 a - 4,96 y se fotografiaron con un microscopio de fluorescencia Olympus BX51 (Olympus, Alemania) conectado a una cámara Olympus DP72 (Olympus, Alemania). Se contaron todas las neuronas claras que expresaban c-Fos (FiJi v2.0.0, Institutos Nacionales de Salud; Maryland).

Para evaluar si STN-DBS influyó en la síntesis de 5-HT de eYFP que expresan neuronas 5-HT DRN, el tejido se procesó para inmunohistoquímica TPH2, que es la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de 5-HT. Las secciones de DRN se incubaron durante la noche con un anticuerpo anti-TPH2 primario (anti-TPH2 policlonal de cabra; Abcam; 1:2000). A esto le siguió una incubación con un anticuerpo secundario (burro anti-cabra alexa 647, Jackson Immunoresearch Laboratories; 1:200) durante dos horas. Se realizó un análisis estereológico de neuronas eYFP/TPH2 doblemente marcadas (Stereo Investigator, Microbrightfield Bioscience, Williston, VT, EE. UU.) en siete secciones DRN por ratón usando un microscopio confocal de disco giratorio de fluorescencia (DSU, Olympus BX51, Japón) conectado a un digital Cámara CCD de ultra alta sensibilidad (C9100-02, Hamamatsu Photonics, Japón). El recuento estereológico de células se realizó con la sonda de fraccionamiento óptico y el número total de células doblemente marcadas se estimó con un método estereológico validado43,44.

El análisis estadístico se realizó con el software SPSS 26.0 (SPSS Inc., Chicago, EE. UU.). Los datos de comportamiento e inmunohistoquímicos se analizaron mediante ANOVA de dos vías. Se realizó una comparación por pares post-hoc de Bonferroni si (y solo si) el resultado de la prueba ANOVA global era significativo. Para comparar los datos de los dos grupos, utilizamos una prueba T independiente. Los datos se presentan como valores medios y error estándar de las medias (± SEM). Todos los datos se distribuyeron normalmente y la significación estadística se definió por un valor de p < 0,05. Los datos de fotometría se procesaron y analizaron con scripts personalizados de Matlab (MathWorks). Se realizó una prueba de permutación para evaluar estadísticamente los transitorios de calcio40.

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Este trabajo fue financiado por la Organización Holandesa para la Investigación Científica, subvención no: 91616043 (NWO-VENI) a AJ. FA agradece a la Universidad Rey Abdulaziz por su beca de doctorado. Los autores agradecen a la Sra. Pol por su contribución a los experimentos in vivo.

Departamento de Neurocirugía, Centro Médico de la Universidad de Maastricht, P. Debyelaan 25, 6202AZ, Maastricht, Países Bajos

Faisal Alosaimi, Yasin Temel, Sarah Hescham, Faris Almasabi, Sonny KH Tan y Ali Jahanshahi

Departamento de Neurología, Hospital Universitario RWTH Aachen, Aachen, Alemania

victoria s divertido

Departamento de Neurocirugía, Hospital Universitario RWTH Aachen, Aachen, Alemania

sonny kh bronceado

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AJ diseñó el estudio, AJ realizó el trabajo in vivo, FA, VW y FA (F. Almasabi) realizaron el trabajo de inmunohistoquímica y microscopía, AJ diseñó y adaptó el programa del trabajo in vivo y apoyó la gestión de los datos sin procesar, AJ y FA analizó los datos y escribió el manuscrito, SH, ST y YT contribuyeron a la interpretación de los datos, redacción y edición del manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Ali Jahanshahi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Alosaimi, F., Temel, Y., Hescham, S. et al. La estimulación de alta frecuencia del núcleo subtalámico induce una inhibición sostenida del sistema serotoninérgico a través de la pérdida del fenotipo celular. Informe científico 12, 14011 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18294-6

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Recibido: 04 enero 2022

Aceptado: 09 agosto 2022

Publicado: 17 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18294-6

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