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Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3286 (2022) Citar este artículo

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Para avanzar en nuestra comprensión de los circuitos neuronales, es fundamental desarrollar interfaces multimodales mínimamente invasivas capaces de registrar y modular simultáneamente la actividad neuronal. Los dispositivos recientes se han centrado en igualar la flexibilidad mecánica del tejido para reducir las respuestas inflamatorias. Sin embargo, se necesitan reducciones en el tamaño de las interfaces multimodales para mejorar aún más la biocompatibilidad y las capacidades de registro a largo plazo. Aquí se presenta un diseño de microsonda coaxial multimodal con una huella mínimamente invasiva (8–14 µm de diámetro en longitudes milimétricas) que permite una interrogación eléctrica y óptica eficiente de las redes neuronales. En el cerebro, las sondas permitieron mediciones eléctricas sólidas y estimulación optogenética. Las estrategias de fabricación escalables se pueden utilizar con diversos materiales eléctricos y ópticos, lo que hace que las sondas se puedan personalizar en gran medida según los requisitos experimentales, incluidos la longitud, el diámetro y las propiedades mecánicas. Dada su respuesta inflamatoria insignificante, estas sondas prometen habilitar una nueva generación de dispositivos multimodales fácilmente ajustables para una interfaz mínimamente invasiva a largo plazo con circuitos neuronales.

Las grabaciones de microelectrodos son el estándar de oro para medir la actividad de las neuronas individuales a alta resolución temporal en cualquier región del sistema nervioso y son fundamentales para definir el papel de los circuitos neuronales en el control del comportamiento. Las matrices de microelectrodos, como las matrices de Utah o Michigan, han permitido el seguimiento de la actividad neuronal distribuida con una precisión de milisegundos1,2. Sin embargo, su gran tamaño y rigidez provocan daño e inflamación de los tejidos que dificultan las grabaciones a largo plazo3,4. Las sondas de fibra de carbono y Neuropixel de última generación han mejorado estos dispositivos anteriores al aumentar la densidad de los electrodos y reducir las dimensiones y la rigidez de la sonda5,6,7. Aunque estas sondas han avanzado en el campo de la interfaz neuronal, los dispositivos de próxima generación deberían permitir la estimulación dirigida además de los registros eléctricos colocados3,8. Las técnicas optogenéticas permiten la modulación de alta velocidad de la actividad celular a través de la expresión y activación específicas de opsinas sensibles a la luz9. Sin embargo, dada la fuerte dispersión de la luz y las propiedades de alta absorción del tejido neural, la interfaz optogenética con los circuitos neurales profundos generalmente requiere la implantación de fibras rígidas de gran diámetro, lo que puede hacer que este enfoque sea más invasivo que su contraparte eléctrica10,11,12.

La sonda neural ideal combinaría los modos óptico y eléctrico manteniendo pequeñas dimensiones de sección transversal y longitudes ajustables. La capacidad de interactuar bidireccionalmente con tipos y circuitos de neuronas definidos genéticamente es clave para poder comprender en última instancia cómo el sistema nervioso calcula y controla el comportamiento. También es fundamental para determinar la base mecánica de los trastornos sensoriomotores, definiendo cómo la actividad del circuito se ve afectada por una lesión y cómo se puede restaurar o facilitar. Los enfoques para integrar las modalidades ópticas y eléctricas van desde agregar fibra óptica a los arreglos Utah existentes hasta el Optetrode u otras estructuras coaxiales electro-ópticas integradas13,14,15,16,17. Estas tecnologías se han mostrado muy prometedoras para grabaciones eléctricas simultáneas y estimulación óptica in vivo. Sin embargo, la necesidad de reducir la huella del dispositivo para minimizar las respuestas inmunitarias para registros a largo plazo sigue presente3,18,19,20,21.

En este trabajo, presentamos, según nuestro conocimiento, la sonda neural coaxial multimodal más pequeña con un canal eléctrico de baja impedancia que rodea un pequeño núcleo central de fibra óptica. Estas sondas electro-ópticas mecánicamente flexibles (EO-Flex) se pueden fabricar con diámetros tan pequeños como 8 µm y longitudes de hasta varios milímetros utilizando núcleos de guía de ondas ópticas de microfibra o incluso diámetros más pequeños con núcleos ópticos de nanofibras. También se pueden unir directamente a fibras monomodo (SMF) para crear interfaces ópticas desmontables de baja pérdida que se pueden conectar directamente al hardware optogenético estándar. El registro eléctrico simultáneo y el rendimiento de la estimulación óptica de las sondas EO-Flex se demuestran en el cerebro del ratón. Nuestros experimentos muestran que el canal eléctrico de metal poroso proporciona una excelente capacidad de grabación incluso con el pequeño tamaño de la sonda. Las bajas pérdidas ópticas desde la fuente hasta la punta de <10 dB permiten una estimulación optogenética robusta en ratones transgénicos o transducidos viralmente que expresan opsinas en las células diana. Los estudios de implantes muestran respuestas inmunitarias mínimas, lo que sugiere que la sonda totalmente personalizable y las futuras matrices de alta densidad deberían permitir una interfaz a largo plazo con una alteración mínima del tejido neural circundante.

Las sondas EO-Flex se fabricaron utilizando núcleos ópticos de micro y nanofibra (ver Métodos). Aquí, nos centraremos en las microfibras de sílice de producción masiva como el núcleo que habilita sondas con longitudes que superan los 3 mm mientras mantienen un diámetro de <12 µm (Fig. S16a). Sin embargo, el protocolo de fabricación es general y se puede usar con otros núcleos ópticos, incluidas las guías de onda de nanofibras de óxido metálico de longitud de onda inferior, para producir sondas ultraminiaturizadas (Fig. S3). Para permitir un acoplamiento eficiente al hardware optogenético, las microfibras se colocaron primero en un sustrato de silicio, con un extremo de la fibra sobresaliendo del borde del sustrato, y luego se acoplaron a tope a un SMF escindido (Fig. 1a). Utilizamos alineación activa para maximizar la superposición de modos entre la microfibra y SMF. El acoplamiento se bloqueó usando una gota de adhesivo óptico curable con UV en el extremo del SMF (Fig. 1b).

a Las microfibras de sílice de longitud definida se colocan sobre un sustrato de silicio para permitir que una férula cargada con fibra monomodo (SMF) se adhiera a la microfibra. b (de arriba a abajo) Las fotografías muestran el proceso activo de alineación y unión del acoplamiento de la microfibra al SMF. c Esquema de la configuración de electrodeposición para depositar poli(3,4-etilendioxitiofeno) poliestireno sulfonato (PEDOT:PSS) después de la pulverización catódica de óxido de iridio (IrOx). d Imagen óptica de la salida de luz de una sonda desde el costado cuando la luz se refleja en un espejo, y desde la faceta final dividida (recuadros de acercamiento) con y sin luz láser. (recuadro) Imagen de fluorescencia que captura el ángulo del cono de la sonda después de sumergirla en una solución de colorante y lanzar luz azul (442 nm) en la sonda. Se generaron micrografías en un par de experimentos. e Micrografía electrónica de sección transversal de una sonda EO-Flex después de fresar el extremo que muestra los anillos conductores expuestos junto con el núcleo de vidrio óptico (SiOx). Se registraron micrografías electrónicas múltiples para sondas similares que dieron como resultado propiedades similares. f Datos EIS para sondas fresadas con (línea negra) y sin (línea verde) el revestimiento PEDOT:PSS. La impedancia promedio se muestra con el área ligeramente sombreada que representa una desviación estándar para n = 4 sondas. g Una vista transversal de la sonda que muestra sus diversas capas de revestimiento. h Fotografía de una sonda EO-Flex completa con un acercamiento de la región de la punta de microfibra. Para estrategias de escalamiento, vea la Fig. S16.

Para crear una interfaz desmontable robusta para las pruebas in vivo, el SMF se insertó en una férula de cerámica. El extremo distal del ensamblaje de la férula se pulió a máquina para permitir el acoplamiento a un cable de conexión (Fig. 1g, h). Son concebibles otros diseños de interfaz para diferentes aplicaciones (Fig. S16). Para formar una capa eléctricamente conductora de bajo ruido alrededor de la punta de la sonda, se pulverizó una capa de óxido de iridio (IrOx) de 379 ± 43 nm sobre las microfibras seguida de una capa de poli(3,4-etilendioxitiofeno) poliestireno depositada electroquímicamente de 362 ± 137 nm. sulfonato (PEDOT:PSS) (Fig. 1c)22. La naturaleza porosa de IrOx permitió una mejor adhesión de la capa conductora de PEDOT:PSS y mejoró el rendimiento eléctrico general de la sonda. La sonda se pasiva con 1,76 ± 0,16 µm de Parylene-C para aislar eléctricamente la sonda y proporcionar una superficie biocompatible (Fig. S2). Para exponer las superficies eléctricas y ópticas, se utilizó un haz de iones enfocado para cortar la punta (Fig. 1e; consulte la Información de apoyo). La figura 1g muestra el diseño final de la sonda y la figura 1h muestra una fotografía de una sonda completa. Mediante la combinación de IrOx y PEDOT:PSS, se lograron impedancias eléctricas de <1 MΩ a 1 kHz a partir de áreas de electrodos de <15 µm2 (Fig. 1f).

Las propiedades ópticas de las sondas se evaluaron primero al obtener imágenes del ángulo del cono de salida en una solución de colorante (Fig. 1d, recuadro), que mostró un ángulo de divergencia de 10 a 15 °. Es importante destacar que, después de colocar las capas de revestimiento en la sonda, no se observa ninguna luz de dispersión detectable desde la interfaz de microfibra/SMF (Fig. 1d) en comparación con la sonda de revestimiento previo (Fig. 1b). Las pérdidas ópticas entre un cable de conexión acoplado por láser y la salida EO-Flex se cuantificaron utilizando tres longitudes de onda diferentes (473, 543, 600 nm) y todos los dispositivos mostraron <7 dB (n = 4). Estos valores coinciden bien con los resultados simulados para una desalineación del modo de ~2 µm en el manguito de la férula (Fig. S1). La espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) se realizó en las sondas mientras estaban sumergidas en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Todas las sondas fabricadas y probadas mostraron una impedancia eléctrica promedio de 844 ± 179 kΩ a 1 kHz (n = 4; Fig. 1f y Fig. S2a–d) después de la deposición del revestimiento y el fresado de la punta, en comparación con >10 MΩ antes de la deposición de PEDOT.

Para confirmar que las sondas EO-Flex permiten mediciones eléctricas de alta sensibilidad in vivo, realizamos grabaciones extracelulares simultáneas e imágenes de dos fotones en la corteza de ratones anestesiados con isoflurano con células marcadas con fluorescencia (ver Información de apoyo)23,24. Este enfoque permitió monitorear la inserción y el movimiento dirigido de la sonda a través del tejido (Fig. 2a). Las sondas penetraron fácilmente en la duramadre expuesta con un pandeo mínimo al usar inmersión en agua (Video S1) y alcanzaron las regiones objetivo en la capa cortical 2/3 ópticamente accesible (Fig. S12 y Video S2). Cuando se montó en un micromanipulador de tres ejes, el ajuste fino de la posición lateral de la punta de la sonda, una vez dentro del tejido, fue factible para optimizar la relación señal-ruido y apuntar a las neuronas individuales. Sin embargo, el movimiento lateral se limitó típicamente a <30 µm. Usando este enfoque, adquirimos actividad endógena de unidades múltiples y únicas (Fig. 2b). Se utilizaron el análisis de componentes principales (PCA) y el agrupamiento gaussiano de registros eléctricos para determinar el número de unidades distintas (Fig. 2c). Las tasas de aumento se calcularon utilizando un algoritmo Bayesian Adaptive Kernel Smoother (BAKS) aplicado a la duración total de la grabación (Fig. 2d)25. La Figura 2b–e muestra una grabación representativa. Usando una sonda EO-Flex de ~1 mm de largo, también obtuvimos registros eléctricos de áreas corticales más profundas hasta la longitud máxima de las sondas. La firma eléctrica de estas grabaciones sugiere que se puede acceder a todas las capas corticales (Fig. S4).

un esquema que muestra la configuración utilizada para las mediciones eléctricas guiadas visualmente. Se utilizaron imágenes de dos fotones de la sonda en relación con las células marcadas con fluorescencia (ver Métodos) para rastrear su movimiento a través del tejido y optimizar la posición de grabación. (recuadro) Vista transversal ampliada de la preparación quirúrgica para imágenes y registros eléctricos simultáneos. b Ejemplo de registro de EO-Flex que muestra actividad neuronal espontánea en la capa cortical 2/3 (profundidad = 250 µm) de un ratón anestesiado con isoflurano. El umbral (línea roja) que define un pico se estableció en \({{{{{\rm{Threshold}}}}}}=4* {{{{{\rm{median}}}}}}\left( \frac{\left|{{{{{\rm{Grabación}}}}}}\right|}{0.675}\right)\) basado en literatura publicada36. (región encuadrada) Un extracto de un segundo de la grabación muestra la actividad de varias unidades. c Gráfica de análisis de componentes principales (PC) del agrupamiento de formas de onda utilizando métodos de agrupamiento establecidos37. d La tasa de picos durante el registro de 1 minuto que se muestra en (b) se calculó mediante una estimación del kernel bayesiano. e Formas de onda promedio (líneas continuas) junto con una desviación estándar (regiones sombreadas) para cuatro grupos determinados por PCA a partir de la grabación en (b).

Luego, para demostrar la capacidad de las sondas EO-Flex para registrar la actividad evocada periféricamente, las insertamos en la corteza del barril, que recibe información sensorial de los bigotes en el lado opuesto del cuerpo. Mientras avanzaba la sonda en el cerebro, desviamos periódicamente los bigotes usando bocanadas de aire mientras el animal todavía estaba bajo anestesia con isoflurano. Una vez que se observó la actividad correlacionada, se bloqueó la posición de la sonda (inserción de ~900 µm) y se apagó la anestesia. Las mediciones comenzaron entre 30 y 60 minutos después de que los animales comenzaran a caminar. Se utilizaron grabaciones de video para verificar las desviaciones de los bigotes mediadas por soplos de aire y registrar el comportamiento de los batidos espontáneos bajo iluminación infrarroja (Fig. 3a-c). Además, la actividad locomotora del ratón se registró utilizando un codificador óptico conectado a la cinta rodante esférica en la que se colocó el animal. Los bigotes se desviaron usando varias frecuencias de pulso (2, 3 y 5 Hz) y anchos (20 y 50 ms) (Fig. 3f-q), lo que provocó aumentos en la tasa de picos dependientes del estímulo, que fueron más pronunciados durante los períodos de descanso. (es decir, en ausencia de batido espontáneo). Para corroborar aún más el posicionamiento de la sonda en la corteza del barril, realizamos estimulaciones eléctricas mediadas por sonda EO-Flex (pulsos bifásicos de 0–300 µA a 100 Hz), lo que resultó en desviaciones de bigotes dependientes de la amplitud actual (Fig. S5).

un esquema de la configuración experimental. Los bigotes se desviaron mediante estímulos de bocanadas de aire administrados a través de una micropipeta conectada a un sistema de presión controlado por un generador de funciones (Picospritzer). El generador de funciones también controlaba un LED infrarrojo para la sincronización de datos analógicos y de video. b Cuadro de video que muestra al animal en reposo antes de la desviación del bigote. La flecha azul indica un bigote de ejemplo. El círculo rojo indica la ubicación del LED infrarrojo. c Fotograma de video que muestra la desviación del bigote indicado durante la administración de soplos de aire. d Ejemplo de registro de EO-Flex (negro) durante la estimulación de bigotes de 3 Hz (amarillo). e Formas de onda promedio ordenadas de picos correspondientes con una desviación estándar sombreada. Las diferentes formas de onda neuronales están marcadas con diferentes colores. Gráfico ráster f – h que muestra la actividad provocada por el estímulo de los bigotes para una frecuencia de estimulación de 2 Hz (ancho de pulso de 50 ms) (f), histograma de tiempo periestímulo (g) y estimación BAKS de la frecuencia de disparo (h). Gráfico ráster i–k (i), histograma de tiempo de periestímulo (j) y estimación BAKS para una estimulación de 3 Hz (ancho de pulso de 50 ms). Gráfico ráster l–n (l), histograma de tiempo de periestímulo (m) y estimación BAKS (n) para estimulación de 5 Hz (ancho de pulso de 50 ms). o–q Gráfico ráster (o), histograma de tiempo de periestímulo (p) y estimación BAKS (q) para estimulación de 3 Hz (ancho de pulso de 20 ms). Panel (a) creado con Biorender.com.

Para demostrar la capacidad de las sondas EO-Flex para evocar ópticamente la actividad neuronal mientras se registra eléctricamente simultáneamente con la misma sonda, realizamos experimentos en ratones Thy1-ChR2-YFP anestesiados con canal iónico activado por luz azul Canalrodopsina-2 (ChR2) expresión en neuronas . Las sondas se insertaron en la capa cortical 2/3 bajo control visual. Se acopló a la sonda un láser de estado sólido bombeado por diodo (DPSS) de 473 nm, adecuado para excitar ChR2, y los parámetros de estimulación se barrieron sistemáticamente (Figs. S6, S8, S9). Variamos la frecuencia de estimulación (10–50 Hz), el ancho del pulso (0,6–9,8 ms) y la potencia de salida (5–208 µW) para determinar la configuración óptima para excitar las neuronas que expresan ChR2. Usando el análisis de forma de onda en la actividad eléctrica registrada simultáneamente, encontramos que se requería una potencia mínima de 29 µW (2849 mW mm−2) para disparar las celdas en sincronía con el tren de pulsos ópticos (Fig. S6). En el registro de ejemplo que se muestra en la Fig. 4a-b, PCA combinado con un ajuste gaussiano mixto para la agrupación de los datos produjo dos grupos primarios (Fig. 4c) con dos formas de onda diferentes (Fig. 4d) que ocurren durante el período de estimulación (Fig. .4e–g). Encontramos una interferencia mínima (p. ej., efecto Becquerel) entre los canales ópticos y eléctricos proximales, como se demostró al probar los dispositivos EO-Flex en animales no transgénicos con potencia óptica máxima y frecuencias de estimulación similares (Fig. S10). Se demostró una mayor validación de la ausencia del efecto Becquerel al retraer la sonda EO-Flex lejos de las neuronas que expresan ChR2, o al colocarla en una solución tampón, mientras se bombeaba ópticamente a una potencia de láser similar (208 µW) utilizando los mismos trenes de pulsos optogenéticos. (Figura S11). A esta potencia máxima, los circuitos neuronales respondieron con un retraso temporal mínimo (Fig. S6f) y podían seguir estímulos de frecuencia de hasta 40 Hz antes de esforzarse por mantener el disparo sincronizado (Fig. S9).

a Actividad neural evocada ópticamente utilizando un tren de pulsos de 20 Hz (barras azules) de luz de 473 nm (ancho de pulso de 4,95 ms) con una potencia de punta de 61 µW ciclada y apagada a 1 Hz. La línea de umbral (roja) se estableció como se define36 en la Fig. 2. b Gráfica de tasa de picos para el registro en (a). c Gráfica de componente principal (PC) para la actividad neuronal evocada ópticamente. Los grupos separados se colorean de manera diferente. d Formas de onda promedio (línea verde o negra continua) para cada grupo en (c) junto con una desviación estándar (región sombreada). e Cada grupo (negro o verde coordinado por color) representado en el tiempo junto con la ventana de un solo pulso (barra azul). f Estimación bayesiana de suavizado del núcleo de la tasa de picos para cada período de estimulación. g Gráfico raster coloreado que muestra la ocurrencia de formas de onda de (d). h Tasa de pico promedio calculada durante la duración de 1 s de un solo ciclo pulsante.

La capacidad de las sondas EO-Flex para evocar ópticamente la actividad neuronal se verificó aún más mediante imágenes de calcio de dos fotones en ratones Vglut2-GCaMP6f inyectados con un vector AAV2-CaMKII-C1V1-mCherry (ver Métodos). De cuatro a cinco semanas después de la inyección cortical, se insertaron sondas EO-Flex en las regiones de capa 2/3 que expresan la opsina C1V1 activada por luz verde. Se acopló un láser DPSS de 556 nm a la sonda EO-Flex y se barrieron los parámetros de estimulación mientras se controlaban simultáneamente los transitorios de calcio neuronal. Los pulsos ópticos administrados condujeron a un aumento de calcio correlacionado en las neuronas positivas para C1V1 dentro del campo de visión (Fig. S12). La evocación óptica exitosa de la actividad neuronal también se verificó mediante grabaciones eléctricas simultáneas (Fig. S12e). Juntos, nuestros datos in vivo demuestran la capacidad de las sondas EO-Flex para registrar eléctricamente y modular ópticamente la actividad neuronal en el cerebro intacto.

Las sondas EO-Flex permiten la orientación y el arrastre de células que expresan opsina a velocidades de disparo que van de 10 a 50 Hz (Fig. S9). Si bien la potencia mínima (29 µW) para activar neuronas de manera confiable es más alta que en informes anteriores (1–10 mW mm−2)15,26,27, se debe tener en cuenta que debido al pequeño núcleo óptico de las sondas EO-Flex ( 3,6 µm) y la absorción y dispersión anticipada de la luz del tejido, se espera que las intensidades más altas creen volúmenes de iluminación lo suficientemente grandes y fuertes para reclutar neuronas con éxito en comparación con las fibras ópticas convencionales de núcleo más grande. Las simulaciones de Monte Carlo en la Fig. S6b indican que a una potencia de estimulación de 29 µW, la densidad de potencia óptica cae por debajo del umbral optogenético de 1 mW mm−2 a aproximadamente 1,2 mm de la punta. Incluso con la máxima potencia de estimulación utilizada en nuestros experimentos optogenéticos (208 µW o 20 435 mW mm−2 en la punta de la sonda), no observamos ningún efecto celular adverso (p. ej., cambios sostenidos en la tasa de activación o los niveles de calcio) (Figs. S10 –12). Estudios recientes han sugerido que la exposición óptica continua con potencias <0,25 mW no produce efectos de la temperatura en la actividad neuronal (es decir, señales eléctricas degradadas durante el período de estimulación)28. Para garantizar aún más los efectos mínimos de calentamiento óptico en el tejido neural, utilizamos anchos de pulso cortos y potencias ópticas de menos de 250 µW (Figs. S6-10). Se esperan efectos de calentamiento mínimos cuando se usan estos parámetros de iluminación, lo cual se verificó aplicando modelos de calentamiento previamente validados a las sondas EO-Flex (Fig. S7b)29.

A continuación, evaluamos la respuesta del cerebro a la implantación de la sonda. Se implantaron sondas EO-Flex en la corteza de ratones heterocigotos Cx3cr1-GFP con microglía marcada durante 6 y 30 días. Se insertó una fibra multimodo de 250 µm de diámetro, comúnmente utilizada en experimentos optogenéticos, usando las mismas coordenadas estereotáxicas pero en el hemisferio opuesto para comparar. Se prepararon secciones de cerebro en serie que incluían ambos sitios de implantación. Los cortes de tejido se tiñeron conjuntamente con anticuerpos anti-GFAP y anti-NeuN para cuantificar la astrogliosis reactiva y la pérdida neuronal, respectivamente (n = 4 ratones; N = 8 secciones por ratón) (Fig. 5 y Figs. S14, 15). En el día 6 después de la implantación, encontramos que la fibra multimodo provocó una pérdida neuronal significativa, un aumento de 2,08 ± 0,23 veces en el número de microglia y un aumento de 2,68 ± 0,60 veces en los niveles de GFAP (Fig. 5e-g). Por el contrario, las sondas EO-Flex no mostraron una disminución significativa en las células positivas para NeuN ni un aumento en el número de microglia o los niveles de GFAP alrededor del sitio de inserción (Fig. 5e-g). El día 30 después de la implantación, se observó nuevamente pérdida neuronal para la fibra multimodo de control implantada, así como un aumento de 2,33 ± 0,27 veces en el número de microglías y un aumento de 2,81 ± 0,63 veces en los niveles de GFAP (Fig. 5l-n) . Por el contrario, las sondas EO-Flex no mostraron una disminución significativa en las células positivas para NeuN ni un aumento en los niveles de GFAP, pero sí un pequeño aumento en el número de microglia (Fig. 5l-n). Estos resultados indican que las respuestas de los tejidos a la inserción o movimiento de la sonda EO-Flex durante el período de implantación son insignificantes en los momentos en que las respuestas inflamatorias suelen ser más prominentes y considerablemente más pequeñas en comparación con las sondas estándar utilizadas para experimentos optogenéticos30. Finalmente, dada esta mínima respuesta inmune, también realizamos registros crónicos hasta 30 días después de la implantación de la sonda EO-Flex. Estas grabaciones revelaron excelentes relaciones señal-ruido en todos los puntos de tiempo investigados (día 0, 1, 2, 6 y 30) (Fig. S13).

a, b Imágenes ópticas que muestran secciones cerebrales coronales de 20 µm de espesor alrededor de los sitios de implantación de la fibra multimodo (a) y la sonda EO-Flex (b). Tanto la fibra multimodo (diámetro, 250 µm) como la sonda EO-Flex (diámetro, 12 µm) se avanzaron hasta una profundidad de ~1 mm en la corteza. Las imágenes se tomaron 6 días después de la implantación en ratones heterocigotos Cx3cr1-GFP con microglía marcada (verde). Las secciones se tiñeron conjuntamente con anticuerpos anti-NeuN (azul) y anti-GFAP (magenta) para marcar neuronas y astrocitos, respectivamente. c, d Imagen de mayor resolución de una región ampliada de (a, b) donde se ubicaron las puntas de la sonda. e–g Análisis de población (n = 16 secciones de dos animales) que muestra el impacto de la fibra multimodo o la implantación de la sonda EO-Flex en el número de células neuronales (e), la reactividad de los astrocitos medida por el nivel de expresión de GFAP (f) y la reactividad de la microglía medido por el número de células microgliales (g) para la implantación de 6 días. Las respuestas celulares se cuantificaron y promediaron en dos regiones de análisis de 150 µm × 1 mm que flanquean cada sitio de inserción. Para distinguir la cirugía de las respuestas tisulares relacionadas con la sonda, se realizó una craneotomía adicional de tamaño comparable 0,7 mm lateral a cada sitio de implantación del dispositivo. Se utilizó el mismo enfoque de análisis para cuantificar las respuestas celulares en este sitio de cirugía simulada. Las pruebas t pareadas de dos colas determinaron los valores de P. h, i Imágenes ópticas de la sección coronal del cerebro tomadas 30 días después de la implantación de la fibra multimodo (h) y la sonda EO-Flex (i). j, k Imagen de mayor resolución de una región ampliada de (h) e (i) donde se ubicaron las puntas de la sonda. l–n Análisis de la población correspondiente (n = 16 secciones de dos animales) que muestra el número de células neuronales (l), la reactividad de los astrocitos (m) y la reactividad de la microglía (n) para la implantación de 30 días. Las pruebas t pareadas de dos colas determinaron los valores de P. Se utilizó la siguiente convención para indicar los valores de P: "ns" indica P > 0,05, "*" indica 0,01 < P ≤ 0,05, "**" indica 0,001 < P ≤ 0,01 y "***" indica 0,0001 < P ≤ 0.001. Todos los gráficos de barras se presentan como media ± sem

En resumen, informamos sobre la fabricación de microsondas coaxiales multimodales y demostramos su capacidad para estimular ópticamente y registrar eléctricamente circuitos neuronales intrínsecos con una interferencia mínima entre las dos modalidades. El tamaño pequeño y la alta relación de aspecto de las sondas EO-Flex permiten una interfaz mínimamente invasiva con los circuitos neuronales. Es posible una mayor reducción de tamaño con este diseño coaxial utilizando núcleos de fibra óptica más pequeños; sin embargo, la compensación es un aumento en las pérdidas ópticas y la impedancia eléctrica (Fig. S3). Aunque las capacidades de las sondas solo se probaron en el cerebro, como una plataforma con excelente control sobre el diámetro y la longitud de la sonda, la elección de materiales de revestimiento con varias composiciones químicas, flexibilidad mecánica inherente y una ruta clara para aumentar las densidades de la sonda (p. ej., traduciendo el proceso de deposición del revestimiento a haces de fibras) (Fig. S16c), esta tecnología debería encontrar aplicaciones inmediatas como interfaces mínimamente invasivas en diversas regiones del sistema nervioso, incluida la médula espinal y los nervios periféricos.

El desarrollo de sondas que pueden llegar a regiones cerebrales aún más profundas es sencillo con los protocolos de fabricación desarrollados, ya que se puede generar prácticamente cualquier longitud de microfibra (Fig. S16a). Sin embargo, para un conjunto dado de capas de revestimiento, la rigidez de la sonda disminuye con la longitud. Por lo tanto, las sondas más largas pueden requerir tácticas adicionales para superar las bajas fuerzas de pandeo durante el proceso de inserción (p. ej., recubrimientos de azúcar solubles o capas de polímero rígido)31. Alternativamente, una incisión quirúrgica en la duramadre podría facilitar la inserción de la sonda. Independientemente de la longitud de la sonda, nuestros estudios de implantación demostraron que las sondas EO-Flex de tamaño reducido tienen una respuesta inmunitaria drásticamente reducida en comparación con las fibras multimodo estándar.

Se generaron microfibras de sílice (diámetros de núcleo y total: 3,63 ± 0,31 µm y 5,60 ± 0,42 µm, respectivamente) con longitudes que varían entre 500 µm y 1 cm a partir de haces de fibra óptica extraídos (Schott, n.° de pieza 1573179). Después de la escisión, las fibras individuales se dispersaron sobre un sustrato de silicio. Se usó una aguja de tungsteno montada en un micromanipulador de tres ejes para colocar las microfibras cerca del borde del sustrato con un extremo de la fibra suspendido a >100 µm del borde.

Para permitir un acoplamiento óptico eficiente de la guía de onda al hardware optogenético estándar, se eligió una fibra monomodo (SMF) (Thorlabs S405-XP) con un diámetro de campo modal (2,8–3,4 µm) ligeramente más pequeño que el núcleo de microfibra. Para crear una interfaz desmontable robusta para pruebas in vivo, el SMF se insertó en una férula de cerámica (Thorlabs CF126-10) y se aseguró en su lugar con epoxi de curado rápido (DevCon #20445). A continuación, los conjuntos de férulas se pulieron a máquina hasta que se observó una interfaz de acoplamiento suave a través de un microscopio de inspección de fibra (Thorlabs, FS200), y el extremo opuesto de la fibra (para el acoplamiento a la guía de ondas) se cortó con un trazador de rubí (Thorlabs S90R). El ensamblaje de la férula se montó en una plataforma de tres ejes y el extremo trazado se introdujo en una gota de adhesivo óptico curado con UV (Norland Optical Adhesive 81) hasta que se formó una pequeña gota en el extremo. Se logró un acoplamiento eficiente entre SMF y micro/nanofibra usando alineación activa bajo un microscopio óptico vertical (Nikon; software: Amscope v3.7.9229.20170607) equipado con un objetivo 0.4 NA 20x después de acoplar una fuente de láser He-Ne de 544 nm en el SMF. Después de maximizar el acoplamiento de potencia en la guía de ondas traduciendo el SMF, el adhesivo NOA 81 se aseguró exponiéndolo a la luz ultravioleta (línea de 325 nm de un láser HeCd) durante 30 s mientras se movía continuamente el haz alrededor de la gota.

Antes de depositar la capa de metal, los conjuntos de sonda se colocaron en un soporte de bloque de aluminio personalizado para enmascarar la parte inferior de la férula donde se acopla la luz al conjunto. Esto aseguró que la interfaz de acoplamiento óptico estuviera enmascarada durante la metalización. Este bloque se colocó sobre una placa giratoria dentro de una cámara de pulverización catódica (Denton Discovery 18). Se depositó una capa de adhesión delgada (<10 nm) de titanio (2,5 mTorr, 5 s, 200 W), seguida de una capa de óxido de iridio (IrOx) de 300 nm de espesor (12 mTorr, 15 min, 100 W, 5 sccm O2 flujo) o 500 nm de platino (Pt) (2,5 mTorr, 20 min, 200 W). Se eligió el óxido de iridio por su capacidad de inyección de carga ~ 3 veces mayor en comparación con las capas de platino convencionales y su naturaleza porosa, que aumenta el área de superficie electroquímica de la capa de metal32.

Juntos, estos procedimientos produjeron ensamblajes de férula para montaje repetible en una configuración de imagen y optogenética in vivo (Fig. 2). Los diseños de interfaz alternativos (p. ej., para conjuntos de sondas) se muestran en la Fig. S16.

Para reducir aún más la impedancia eléctrica de las sondas, se depositó una capa de poli(3,4-etilendioxitiofeno)-poliestireno sulfonato (PEDOT:PSS) sobre el IrOx. Las sondas se sumergieron (~100 µm de la punta de la sonda) en una solución 0,01 M de EDOT (97 %, Millipore-Sigma) con 2,5 mg/ml de poli(sulfonato de estireno sódico) (PSS; Millipore-Sigma). La deposición electroquímica se realizó utilizando un contraelectrodo de alambre de platino y un electrodo de referencia Ag/AgCl (CHI 111 P, CH Instruments) conectado a un potenciostato electroquímico (VersaSTAT4) que opera en el modo galvanostático configurado para funcionar a una corriente de 200 nA durante 5 –30 s. Esto produjo una capa de polímero de 362 ± 137 nm de espesor (Fig. 1e y Fig. S2). A continuación, las microfibras recubiertas con PEDOT-IrOx (o PEDOT-Pt) se pasivaron con 1,5 a 2 µm de parileno-C mediante deposición química de vapor (SCS Labcoater Deposition System; Specialty Coating Systems).

Se utilizó un haz de iones enfocado (FEI Scios Dual-beam) ajustado a 5 nA a 30 kV para cortar el extremo de la sonda y exponer los canales eléctricos y ópticos, revelando un diámetro de sonda final de 8 a 12 µm para los núcleos de microfibra. . La espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) se llevó a cabo con el Versastat4 (ejecutando VersaStudio v.2.60.6) para determinar la impedancia de la sonda en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x usando la misma referencia y contraelectrodos descritos anteriormente. La eficiencia del acoplamiento óptico se determinó midiendo la salida de luz de un cable de conexión de fibra óptica (Thorlabs, P1405B-FC-5) utilizando tres fuentes de luz (473, 543 y 673 nm) acopladas de manera intercambiable en el cable. La potencia de la luz se midió colocando la férula a una distancia de 5 a 10 mm del cabezal detector de un medidor de potencia digital (Thorlabs, PM100D). Luego, se deslizó una funda de férula de cerámica (Thorlabs, ADAL1) hasta la mitad del cable de conexión y se deslizaron diferentes sondas EO-Flex en el extremo opuesto para acoplar la luz. La potencia de la luz de la punta de las sondas EO-Flex se midió utilizando un protocolo similar al del cable de conexión.

Todos los procedimientos con animales vivos se realizaron siguiendo las pautas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Instituto Salk bajo el protocolo número 13-00022. Para experimentos combinados de optogenética y electrofisiología, utilizamos ratones macho Thy1-ChR2-YFP (n.º de stock 007612; Jackson Laboratories; edad: 10 meses); Para experimentos combinados de imágenes de calcio, optogenética y electrofisiología, utilizamos ratones macho Vglut2-GCaMP6f inyectados con AAV2-CaMKII-C1V1-mCherry (un cruce personalizado entre ratones knock-in Vglut2-Cre y Ai95D; existencias n.º 028863 y n.º 024105, respectivamente ; Jackson Laboratories; edad: 3 meses); para la respuesta inmunitaria y todos los demás estudios, utilizamos ratones macho Cx3cr1-GFP heterocigóticos (n.º de stock 005582; Jackson Laboratories; edad: 9 semanas).

Los procedimientos quirúrgicos siguieron de cerca los protocolos previamente establecidos33,34. Brevemente, se colocaron pipetas de vidrio de pared delgada en un extractor de micropipetas Sutter Flaming/Brown (modelo P-97). Las puntas de las pipetas se cortaron en un ángulo agudo con un aumento de 10x utilizando técnicas estériles. Los diámetros de las puntas eran típicamente de 15 a 20 μm. Se desecharon las pipetas que no dieron como resultado biseles afilados ni tenían diámetros de punta más grandes. Se hicieron marcas milimétricas en cada aguja extraída para medir el volumen de virus inyectado en el cerebro.

Los ratones se anestesiaron con isoflurano (4 % para inducción; 1–1,5 % para mantenimiento) y se colocaron en un sistema estereotáctico asistido por computadora con lectura digital de coordenadas y orientación de atlas (Angle Two, Leica). La temperatura corporal se mantuvo entre 36 y 37 °C con un controlador de temperatura de CC y se usó ungüento oftálmico para evitar que los ojos se secaran. Se usó una pequeña cantidad de crema depiladora (Nair) para eliminar el vello en el sitio designado de la incisión en la piel. La piel se limpió y esterilizó con un lavado en dos etapas de betadina y etanol al 70%. Se realizó una incisión en la línea media que comenzaba justo por detrás de los ojos y terminaba justo pasando la sutura lambda. Se abrió el cuero cabelludo y se limpió el periostio usando un bisturí y unas pinzas para exponer el hemisferio deseado para calibrar el atlas digital y marcar las coordenadas. Una vez que los puntos de referencia (bregma y lambda) se colocaron con la punta de la pipeta y se ingresaron en el programa, se fijó el objetivo deseado en el atlas digital. La pipeta de inyección se movió con cuidado al sitio de destino (coordenadas: AP -1,5 mm, ML 1,5 mm). A continuación, se marcó el sitio de la craneotomía y se usó un microtaladro eléctrico con una broca acanalada (con un diámetro de punta de 0,5 mm) para adelgazar una parte del hueso de 0,5 a 1 mm de diámetro sobre el sitio de inyección objetivo. Una vez que el hueso era lo suficientemente delgado como para flexionarse suavemente, se utilizó una aguja estéril de 30 G con una jeringa adjunta para cortar y levantar con cuidado un segmento pequeño (0,3–0,4 mm) de hueso.

Para la inyección, se pipeteó cuidadosamente una gota del virus en parafilm (1–2 μl) para llenar la aguja de inyección extraída con el volumen deseado. Una vez cargada con el volumen suficiente, la aguja de inyección se introdujo lentamente en el cerebro hasta alcanzar la profundidad deseada (DV 0,2 mm). Se aplicó presión manual con una jeringa de 30 ml conectada mediante un tubo retráctil y se inyectaron lentamente 0,4 μl del vector AAV2-CaMKII-C1V1-mCherry (6,1E + 12 VP/ml; sin diluir; UNC Vector Core) durante 5–10 mín. Una vez que se inyectó el virus, se bloqueó la válvula de presión de la jeringa. La posición se mantuvo durante ~ 10 min para permitir que el virus se propague y evitar el reflujo tras la retracción de la aguja. Después de la inyección, se suturó la piel a lo largo de la incisión. A los ratones se les administró Buprenex SR subcutáneo (0,5 mg por kg) y se les permitió recuperarse antes de colocarlos en su jaula doméstica. Se permitió que el vector se expresara durante 4 a 5 semanas antes de las grabaciones in vivo.

Los procedimientos quirúrgicos siguieron de cerca los protocolos establecidos23,35. Brevemente, los ratones fueron anestesiados con isoflurano (4 a 5 % para la inducción; 1 a 1,5 % para el mantenimiento) y se les implantó una placa para la cabeza en una cama quirúrgica personalizada (Thorlabs). La temperatura corporal se mantuvo entre 36 y 37 °C con un sistema de control de temperatura de CC y se utilizó un ungüento oftálmico para evitar que los ojos se secaran. Se usó crema depiladora (Nair) para eliminar el vello en el sitio designado de la incisión en la piel. La piel se limpió a fondo y se desinfectó con una exfoliación en dos etapas de betadina y etanol al 70%. Se extirpó quirúrgicamente una porción del cuero cabelludo para exponer los segmentos del cráneo frontal, parietal e interparietal. Los bordes del cuero cabelludo se unieron a los lados laterales del cráneo usando un adhesivo compatible con tejidos (Vetbond; 3 M). Se fijó al cráneo una placa de metal maquinada a la medida con cemento dental (cat. #H00335; Coltene Whaledent), lo que permitió estabilizar la cabeza con un soporte personalizado. A los ratones se les administró Buprenex SR (0,5 mg/kg) antes del alivio de la anestesia y se les permitió recuperarse durante al menos tres días antes de la preparación adicional.

Para registros electrofisiológicos y de imágenes combinados, se realizó una craneotomía de ~2 mm × 4 mm de diámetro sobre el área objetivo (p. ej., el sitio de inyección del vector AAV). La duramadre que recubre la corteza se mantuvo intacta. El movimiento del tejido se controló cubriendo el tejido expuesto con una solución de agarosa al 1% y un cubreobjetos. El cubreobjetos se fijó al cráneo con Vetbond (3 M) y cemento dental. Para permitir la entrada de la sonda en la corteza, la agarosa y el cubreobjetos se cortaron en un lado para que quedaran al ras con la craneotomía. Las grabaciones comenzaron inmediatamente después de la preparación de la ventana óptica. La profundidad de la anestesia se controló durante todo el experimento y se ajustó según fuera necesario para mantener una frecuencia respiratoria de aproximadamente 55 a 65 respiraciones por minuto. Se complementó con solución salina según fuera necesario para compensar la pérdida de líquidos.

Para las mediciones electro-ópticas en condiciones de vigilia, los ratones primero se habituaron a la sujeción de la cabeza en una cinta rodante esférica (típicamente tres sesiones, 30-90 min/sesión, una sesión/día en tres días consecutivos). Después de la habituación, se realizó una craneotomía de ~0,3–0,5 mm de diámetro sobre el área objetivo (corteza en barril; coordenadas: AP −1,0 mm, ML 3,0 mm) bajo anestesia general. Luego, los ratones se transfirieron a la cinta rodante esférica y se les permitió recuperarse de la anestesia durante al menos 30 a 60 minutos, dependiendo de la duración que habían pasado bajo anestesia. Después de las mediciones electroópticas, la sonda se bloqueó en su posición cubriendo primero la interfaz de la sonda/tejido con una solución de agarosa al 1 % y luego aplicando Vetbond (3 M) y cemento dental, fijando así la férula al cráneo. Se permitió que los ratones se recuperaran en su jaula antes de las grabaciones posteriores en días diferentes.

Para caracterizar las propiedades electrofisiológicas de las sondas EO-Flex in vivo, realizamos registros extracelulares de una y varias unidades en la corteza de ratones despiertos y anestesiados con isoflurano, de manera similar a nuestro trabajo anterior23,24. El canal eléctrico de las sondas EO-Flex se conectó al terminal positivo de una etapa de cabeza de alta impedancia (amplificador de CA de microelectrodos modelo 1800, AM Systems) usando un adaptador personalizado, mientras que el terminal negativo y la tierra se conectaron a un cable Ag/AgCl insertado encima de la corteza cerebelosa. El adaptador consistía en un bloque de cerámica con un extremo de cable de conexión incrustado y un clip de cobre extraíble soldado a un cable de etapa de cabeza de un solo núcleo. Las sondas EO-Flex se acoplaron con este adaptador deslizando una funda de férula en el extremo del cable de conexión, deslizando la sonda en este ensamblaje y luego bajando el clip de cobre para hacer contacto con la capa de metal en la férula EO-Flex.

Para permitir la inserción de tejido objetivo y el posicionamiento preciso de la sonda, el adaptador se montó en un micromanipulador motorizado (MP-225, Sutter Instrument Company) orientado en un ángulo definido con respecto al cráneo (p. ej., ~60 grados para imágenes combinadas y electrofisiología). , y ~0 grados para mediciones sin imágenes). Después de colocar la punta de la sonda EO-Flex cerca del borde de la craneotomía, se pipetearon unas gotas de solución salina fisiológica en la abertura del cráneo para facilitar la inserción mecánica a través de la interfaz del tejido (Fig. 2a).

El posicionamiento preciso se ayudó al pasar la salida del amplificador diferencial a través de un altavoz para servir como retroalimentación auditiva para la proximidad de la sonda a las células activas. La señal del electrodo sin procesar fue amplificada, filtrada (corte bajo, 300 Hz; corte alto, 5 kHz; ganancia, 1000×), digitalizada (20 kHz; usando DAQExpress 2.0) y almacenada en disco para análisis fuera de línea . El posicionamiento de la punta de la sonda cerca de los cuerpos de las células neuronales se vio favorecido por la retroalimentación visual en experimentos que involucraron imágenes en ratones transgénicos que expresan indicadores fluorescentes.

La estimulación eléctrica (Fig. S5) involucró la entrega de pulsos de corriente mediada por la sonda EO-Flex (amplitud de 0 a 300 µA, frecuencia de estimulación de 100 Hz, ancho de pulso de 0,2 ms, período de estimulación de 1 Hz) con un estimulador de pulso aislado (Modelo 2100; AM Systems ) conectado a un generador de funciones.

La corteza del barril en un hemisferio dado recibe información sensorial de los bigotes ubicados en el lado opuesto del cuerpo. Para desviar los bigotes contralaterales a la ubicación de registro de la sonda, administramos bocanadas de aire con una micropipeta conectada a través de un tubo de plástico a un sistema de presión controlado por un generador de funciones (Picospritzer III; Parker Hannifin Co.). El generador de funciones también operó un LED infrarrojo colocado fuera del campo de visión del animal pero dentro del campo de visión de la cámara de video para sincronizar los datos analógicos y de video. La micropipeta se conectó a un micromanipulador motorizado (MP-225, Sutter Instrument Company), lo que permitió un control preciso sobre los bigotes estimulados. La presión del aire se alejó de la piel y el ojo y se suministró en dirección rostra-caudal. Los estímulos de soplo de aire consistieron en 2 s "encendidos" seguidos de 2 s "apagados", con frecuencias de pulso variables (2 a 5 Hz) y anchos (20 a 100 ms).

Las imágenes in vivo se realizaron23,33 utilizando un microscopio de objetivo móvil (Sutter Instrument Company) equipado con un láser pulsado de femtosegundo Ti:Sapphire (Chameleon Ultra II, Coherent), dos canales de detección de fluorescencia (filtros de emisión: ET525/70 M y ET605/ 70 M (Chroma); divisor de haz dicroico: 565DCXR (Chroma); tubos fotomultiplicadores: H7422-40 GaAsP (Hamamatsu)) y software de adquisición de imágenes MPScope (Kleinfeld lab, UCSD). La longitud de onda de excitación del láser se fijó en 920 nm. La potencia promedio del láser fue <10–15 mW en la superficie del tejido y se ajustó con la profundidad para compensar la pérdida de señal debida a la dispersión y la absorción. Se utilizó un objetivo de inmersión en agua de 16 × 0,8 NA (CFI75, Nikon) o 40 × 0,8 NA (LUMPLFLN, Olympus) para la entrega y recolección de luz. La actividad de calcio evocada ópticamente y espontánea se registró en planos ópticos cerca de la punta de la sonda (velocidad de fotogramas, 8,14 Hz). Para minimizar los artefactos mediados por el efecto Becquerel en los registros eléctricos, la potencia del láser de formación de imágenes se mantuvo al mínimo. Para registrar transitorios de calcio evocados ópticamente en experimentos optogenéticos, sincronizamos la velocidad de fotogramas de la imagen con la entrega del tren de pulsos ópticos y ajustamos la fase de modo que las regiones frente a la punta de la sonda se escanearan cuando el láser DPSS estaba apagado (Fig. S12).

Para excitar ChR2 o C1V1, respectivamente, se acopló a la sonda la luz de un láser DPSS (CNI) de 200 mW 473 o 556 nm, modulada directamente por una señal de generador de función externa. El acoplamiento ligero en la sonda se logró deslizando el extremo pulido de la férula en una funda de cerámica y luego deslizándolo sobre el extremo de un cable de conexión de fibra personalizado. Cada prueba de estimulación duró alrededor de 60 s, con los 5–10 s iniciales designados para registrar la actividad espontánea antes de que se administrara el tren de pulsos ópticos (potencia de estimulación, 6–208 µW; ancho de pulso, 0,6–9,8 ms; frecuencia de estimulación, 10–50 µW). Hz; duración, 1 s; inter-estímulo-intervalo, 1 s entre trenes de pulsos).

A ratones Cx3cr1-GFP heterocigotos (macho, 9 semanas de edad) con microglía marcada se les implantó una sonda EO-Flex y una fibra multimodo de 250 μm de diámetro adecuada para la estimulación cerebral profunda optogenética en hemisferios opuestos (±1,45 mm desde la línea media). Para la implantación, se utilizó un microtaladro eléctrico con una broca estriada (diámetro de punta de 0,5 mm) para adelgazar una parte del hueso de 0,5 a 1 mm de diámetro. Una vez que el hueso era lo suficientemente delgado como para flexionarse suavemente, se utilizó una aguja estéril de 30 G con una jeringa adjunta para cortar y levantar con cuidado un segmento pequeño (0,3–0,4 mm) de hueso. La sonda o fibra multimodo se hizo avanzar a través de esta abertura bajo control visual hasta una profundidad de aproximadamente 1 mm usando un sistema estereotáctico asistido por computadora (Angle Two, Leica). Se usó cemento dental para asegurar los dispositivos en su lugar. La unión firme del cemento dental al cráneo se facilitó escarificándolo con un raspador de huesos (Fine Science Tools). Para distinguir la cirugía de las respuestas tisulares relacionadas con la sonda, realizamos craneotomías adicionales 0,7 mm laterales desde los sitios de implantación del dispositivo (Figs. S14, S15). Para evaluar las respuestas inflamatorias de los tejidos, los ratones se sacrificaron 6 o 30 días después de la implantación del dispositivo usando asfixia con CO2 siguiendo las pautas de IACUC. La perfusión transcardial se realizó con sacarosa al 10 % en PBS, seguida de PFA al 4 % recién preparado en PBS. Ambos hemisferios se fijaron posteriormente en PFA al 4% en PBS durante la noche y posteriormente se infiltraron en sacarosa al 30% en PBS durante un día y se congelaron instantáneamente en un medio de congelación de tejido TBS. Los hemisferios implantados se seccionaron coronalmente a 20 μm, se secaron al aire durante la noche y posteriormente se procesaron para la tinción. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo, luego se lavaron en PBS con Tween-20 al 0,1 % y se incubaron durante dos horas a 22–24 °C en la oscuridad con anticuerpos secundarios acoplados con fluoróforo. Las secciones se lavaron, sellaron con Prolong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) y se almacenaron a 4 °C. Los anticuerpos primarios incluyeron anti-GFAP (monoclonal de ratón; EMD Millipore; cat. #MAB3402; RRID: AB_94844; dilución 1:250) y anti-NeuN (policlonal de conejo; EMD Millipore; cat. #ABN78; RRID: AB_10807945; 1:100 dilución). Los anticuerpos secundarios (1:100) incluyeron Alexa Fluor 405 cabra anti-conejo (Thermo Fisher Scientific; cat. #A-31556; RRID: AB_221605) y Alexa Fluor 633 cabra anti-ratón (Thermo Fisher Scientific; cat. #A-21052 ;RRID: AB_2535719). Las imágenes confocales de secciones de tejido teñidas se realizaron en un Zeiss LSM 710 (software: ZEN Black, Zeiss v2011). Se adquirieron pilas en z en mosaico de tres canales para producir imágenes de secciones de tejido completo (Fig. 5 y Figs. S14, S15). El tamaño de la imagen era de 1024 × 1024 píxeles cosidos en mosaicos de 3–5 × 3–5. Las imágenes se tomaron con un objetivo Olympus 20 × 0.8 NA air-matched.

La actividad neuronal se consideró un pico si su amplitud superaba un umbral determinado por \({{{{{\rm{Threshold}}}}}}=4* {{{{{\rm{median}}}}}}\ left(\frac{{{{{{\rm{|Recording|}}}}}}}{0.675}\right)\) 36. Todos los picos observados se ordenaron luego de acuerdo con los dos primeros componentes principales en grupos usando un Ajuste gaussiano mixto con el número de conglomerados optimizados según la métrica de Calinksi-Harabasz para el análisis de conglomerados37 calculado en MATLAB (R2019b). Las tasas de disparo promedio se calcularon utilizando Bayesian Adaptive Kernel Smoother (BAKS) (v2017; https://github.com/nurahmadi/BAKS). Se utilizaron simulaciones de Monte Carlo para determinar el volumen de propagación e iluminación de la sonda EO-Flex a diferentes potencias (Fig. S6b).

Los perfiles de calentamiento optogenéticos se crearon usando modelos previos29 utilizando la ecuación de biocalor de Pennes. Los parámetros de simulación fueron para un radio óptico de sonda EO-Flex de 1,8 µm, una longitud de onda de 470 nm, una potencia de 1 mW o 208 µW y un radio cilíndrico de 10 µm para promediar la temperatura en las simulaciones basadas en el tiempo (Fig. S7 ).

Los diagramas de periestímulo que correlacionan los estímulos ópticos con los eventos de picos se calcularon utilizando la optimización del ancho de banda del núcleo, que se ha demostrado que estima con precisión la tasa de picos subyacente (Fig. 4b)25.

El análisis de los datos de imágenes de calcio de dos fotones se realizó con Suite2p (Fig. S12)38. Se observaron picos de calcio evocados ópticamente en planos ópticos cerca de la punta de la sonda. Nuestro análisis se centró en los planos ópticos en los que al menos tres regiones de interés (ROI) de tamaño celular respondieron consistentemente a lo largo del período de estimulación.

Los datos de inmunotinción se procesaron, analizaron y trazaron utilizando el software ImageJ (v1.53f51), Imaris (v9.2; Oxford Instruments) y Prism (v8.4.3; GraphPad Prism). Todos los datos se representaron como media ± sem. Los tamaños de muestra del grupo se eligieron en base a estudios previos y análisis de potencia. Las pruebas t pareadas de dos colas determinaron los valores de P. Se utilizó la siguiente convención para indicar los valores de P: "ns" indica P > 0,05, "*" indica 0,01 < P ≤ 0,05, "**" indica 0,001 < P ≤ 0,01 y "***" indica 0,0001 < P ≤ 0.001.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de origen se proporcionan con este documento. Los datos adicionales que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles a pedido de los autores correspondientes. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El código personalizado utilizado para procesar los datos y crear las cifras está disponible en GitHub (https://github.com/Spencer-W/EO-Flex-Algorithms.git). También estará disponible de los autores correspondientes a pedido.

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Descargar referencias

Nos gustaría agradecer a los Dres. Anis Husain y Rob Saperstein (Ziva Corporation) por las discusiones técnicas y las simulaciones electromagnéticas de los primeros prototipos y diseños de EO-Flex. También nos gustaría agradecer a Pavel Shekhmeyster (Instituto Salk) por la asistencia técnica con los experimentos de optogenética, y a Ben Temple y Elischa Sanders (Instituto Salk) por su asesoramiento sobre el análisis de datos electrofisiológicos. Además, nos gustaría agradecer a Samir Damle (UCSD) por su discusión y ayuda con respecto a los procesos de sala limpia. Este trabajo fue patrocinado por el programa de recetas eléctricas (ElectRx) de la Oficina de Tecnologías Biológicas (BTO) de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) bajo los auspicios del Dr. Douglas Weber a través de la Subvención/Contrato de la Oficina de Gestión de Contratos de DARPA No. HR0011-16-2 -0027 (a DJS, SE y AN). Este proyecto también fue apoyado por el Instituto Kavli para el Cerebro y la Mente de UCSD (Subvención No. 2018-1492 para DJS y AN), y los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (R01 NS108034, U19 NS112959 y U01 NS103522 para AN, y Instituto Salk). Este trabajo se realizó en parte en la Infraestructura de Nanotecnología de San Diego (SDNI) de UCSD, miembro de la Infraestructura Nacional Coordinada de Nanotecnología, que cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (Subvención ECCS-1542148 a UC San Diego).

Departamento de Ingeniería Eléctrica e Informática, Universidad de California, San Diego, La Jolla, CA, 92093, EE. UU.

Spencer Ward y Sadik Esener

Departamento de Nanoingeniería, Universidad de California, San Diego, La Jolla, CA, 92093, EE. UU.

Conor Riley, Jenny Nguyen, Sadik Esener y Donald J. Sirbuly

Centro de Biofotónica Avanzada Waitt, Instituto Salk de Estudios Biológicos, La Jolla, CA, 92037, EE. UU.

Erin M. Carey y Axel Nimmerjahn

Ciencia e ingeniería de materiales, Universidad de California, San Diego, La Jolla, CA, 92093, EE. UU.

Donald J Sirbuly

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

SW, CR, SE, AN y DJS conceptualizaron las sondas; SW, CR y JN fabricaron, caracterizaron y probaron las sondas; SW, EMC y AN realizaron los experimentos biológicos; SE, AN y DJS aseguraron la financiación y supervisaron el estudio; SW, AN y DJS analizaron los datos y escribieron el artículo; todos los autores revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Axel Nimmerjahn o Donald J. Sirbuly.

UC San Diego ha presentado una solicitud de patente sobre este trabajo (solicitud n.º 63/076,328), en la que SW, CR, SE, AN y DJS son coinventores. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Communications agradece a Guosong Hong y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Ward, S., Riley, C., Carey, EM et al. Microsondas coaxiales electro-ópticas mecánicamente flexibles para una interfaz mínimamente invasiva con circuitos neurales intrínsecos. Nat Comun 13, 3286 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30275-x

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Recibido: 10 noviembre 2020

Aceptado: 22 de abril de 2022

Publicado: 07 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30275-x

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