Los sistemas de película delgada de cobre y plata a nanoescala muestran diferencias en las propiedades antivirales y antibacterianas

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 7193 (2022) Citar este artículo

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La pandemia actual de la enfermedad por coronavirus 19 (COVID-19) ha ejemplificado la necesidad de estrategias de prevención simples y eficientes que puedan implementarse rápidamente para mitigar los riesgos de infección. Varias superficies tienen una larga historia de propiedades antimicrobianas y están bien descritas para la prevención de infecciones bacterianas. Sin embargo, su efecto sobre muchos virus no ha sido estudiado en profundidad. En el contexto de COVID-19, varias superficies, incluidos los recubrimientos de cobre (Cu) y plata (Ag), se han descrito como medidas antivirales eficientes que pueden implementarse fácilmente para retardar la transmisión viral. En este estudio, detectamos propiedades antivirales contra el Síndrome Respiratorio Agudo Severo Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) en superficies recubiertas con Cu mediante pulverización catódica de magnetrón como películas delgadas de Cu o como nanoparches bimetálicos ultrafinos de Cu/Ag. Sin embargo, no se observó ningún efecto de Ag sobre los títulos virales, en claro contraste con sus conocidas propiedades antibacterianas. La mejora adicional de la cinética de liberación de iones Ag basada en un mecanismo de ánodo de sacrificio electroquímico no aumentó la actividad antiviral. Estos resultados demuestran claramente que los sistemas de película delgada de Cu y Ag muestran diferencias significativas en las propiedades antivirales y antibacterianas que deben tenerse en cuenta al momento de la implementación.

El Cu y el Ag son conocidos como agentes antimicrobianos desde hace siglos, sin embargo, en el campo médico estos metales han experimentado un renacimiento en los últimos años debido a la creciente aparición de microorganismos resistentes a los antibióticos. Además de las aplicaciones de estos metales en numerosos productos de consumo, se utilizan en varios biomateriales o entornos de atención médica para prevenir la colonización bacteriana de implantes y dispositivos o para respaldar los procedimientos de higiene hospitalaria para reducir las infecciones adquiridas en el hospital. Especialmente la propagación pandémica del Síndrome Respiratorio Agudo Severo Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) que causa la Enfermedad por Coronavirus 19 (COVID-19) ha ejemplificado la necesidad de estrategias de intervención de salud pública efectivas que contribuyan a controlar la transmisión del virus. Sin embargo, el desarrollo de superficies antivirales que sean capaces de inactivar partículas de virus adheridas y, por lo tanto, dificulten la transmisión de virus desde superficies contaminadas es un desafío debido a las diferentes propiedades inherentes de los microbios en comparación con los virus.

Ambos, Cu y Ag, ejercen amplias actividades antimicrobianas (bacterias, hongos y virus) y muestran una baja incidencia para inducir resistencia microbiana ya que ambos atacan una amplia gama de objetivos en microorganismos1,2,3. La actividad antibacteriana de Ag está fuertemente relacionada con la liberación de iones Ag (Ag+) que se forman por disolución oxidativa, mientras que, por el contrario, la Ag cerovalente (Ag0) no ejerce una actividad antibacteriana comparable2,4,5,6. Los iones Ag+ interactúan con una variedad de biomoléculas dentro de una célula, como la membrana celular y los componentes de la pared celular, ligandos tiol, por ejemplo, grupos sulfhidrilo de enzimas metabólicas o ácidos nucleicos, y otros. Además, las especies reactivas de oxígeno (ROS) se generan debido a los iones Ag+, lo que provoca efectos nocivos de estrés oxidativo2,7,8. En general, las consecuencias son daños biomoleculares y disfunciones celulares subsecuentes que finalmente inhiben la proliferación bacteriana hasta efectos bactericidas. La eficiencia antibacteriana de Ag se puede mejorar mediante un aumento en el área de superficie de liberación de Ag+ mediante el uso de, por ejemplo, nanopartículas de Ag9. Además, recientemente presentamos un concepto para mejorar la cinética de liberación de Ag+ basado en un mecanismo de ánodo de sacrificio electroquímico10,11,12. Mediante la combinación de Ag con un metal más noble (Au, Pt, Pd o Ir) dentro de un entorno electrolítico (como los fluidos biológicos), el Ag menos noble se corroe a favor de la parte más noble (se "sacrifica"). Hemos demostrado que tales superficies de ánodo de sacrificio ejercen efectos antibacterianos mucho mayores en comparación con las superficies de Ag puro con un total de Ag+ mucho mayor debido a la disolución mejorada de Ag impulsada electroquímicamente. Aunque la actividad antibacteriana de Ag es bien conocida, muy pocos estudios describen los efectos antivirales de Ag y la mayoría de ellos tratan con nanopartículas de Ag13. Recientemente, se informó un efecto virucida del compuesto de sílice/nanocluster de Ag pulverizado en máscaras faciales14.

A diferencia de los materiales de superficie de Ag, las propiedades virucidas de las superficies de Cu y aleaciones de Cu se han estudiado con mayor frecuencia13. Los efectos virucidas del Cu dependen también de la liberación de iones y ambas especies iónicas de Cu (Cu II y Cu I) contribuyen a la actividad biocida15,16,17.

Sorprendentemente, hay una ausencia de estudios comparativos sobre Cu y Ag que oponen sus propiedades bactericidas y virucidas dentro de las mismas configuraciones experimentales utilizando parámetros de recubrimiento iguales y concentraciones de iones metálicos iguales para evitar variaciones en las condiciones de prueba. Los resultados de nuestro estudio son relevantes para el diseño de materiales superficiales que contengan Cu y Ag con especial énfasis en sus actividades virucidas. Por lo tanto, nuestro objetivo fue analizar las propiedades antivirales de las superficies recubiertas con Cu o Ag, así como varias superficies de ánodo de sacrificio basadas en Ag, incluidas combinaciones de Cu y Ag para posibles efectos sinérgicos y comparar el rendimiento antiviral con el antimicrobiano.

Los resultados se lograron utilizando diferentes superficies de película delgada pulverizada (para más detalles, consulte Métodos experimentales): (I) películas delgadas continuas y densas de Ag y Cu (grosor de 50 nm) y (II) superficies nanoestructuradas con áreas superficiales altas. Las superficies nanoestructuradas se sintetizaron (a) depositando secuencialmente Ag sobre Pt, Cu sobre Ag o (b) pulverizando conjuntamente Ag y Pt, así como Cu y Ag. Llamamos a las estructuras superficiales resultantes "nanoparches", es decir, nanoislas formadas por los dos metales. En la Fig. 1 se muestra un flujo de trabajo esquemático. En el caso de la pulverización secuencial (Ag sobre Pt, Cu sobre Ag), los elementos tienden a estar más separados en comparación con la pulverización conjunta, que tiende a mezclar elementos a escala atómica (Ag y Pt , Cu y Ag) y más bien forma una aleación (solución sólida forzada) en comparación con la coexistencia de películas elementales (Ag sobre Pt, Cu sobre Ag). Se espera que este último tenga mejores propiedades de ánodo de sacrificio. Sintetizamos nanoparches de dos espesores diferentes, que ofrecen diferentes volúmenes de material (p. ej., Ag/Pt delgado frente a Ag/Pt grueso) para liberar iones metálicos (Tabla 1). En la figura 2 se muestran ejemplos de imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) de las películas a nanoescala. Las películas de 50 nm de espesor son continuas y muestran diferentes microestructuras superficiales nanocristalinas: la película de Ag es más rugosa y muestra granos más grandes (Fig. 2A) en comparación con la película de Cu (Fig. 2B). Las imágenes SEM y TEM (Fig. 2C-F) de nanoparches (Ag, Ag y Pt, Ag y Cu) muestran que estas nanoestructuras son discontinuas. Se pueden considerar como nanopartículas inmovilizadas y, por lo tanto, ofrecen un área de superficie mayor que las películas continuas. En la referencia 12 se puede encontrar una investigación TEM detallada de la nanoestructura de los nanoparches de Ag-Pt.

Ilustración esquemática (no a escala) de la fabricación de nanoestructuras de película delgada de Cu y Ag por deposición catódica. (A) Cu elemental pulverizado homogéneamente como una película densa y continua con un espesor de 50 nm; (B) Nanoparches de Cu y Ag co-pulverizados durante 120 s; (C) Nanoparches de Cu y Ag pulverizados secuencialmente cada 120 s. Los nanoparches son nanoestructuras en forma de isla con un grosor nominal < 5 nm.

Imágenes ejemplares de microscopía electrónica de películas continuas a nanoescala (A, B) y nanoparches (C–F). (A) Vista superior de SEM de Ag de 50 nm, (B) Vista superior de SEM de Cu de 50 nm, (C) Vista superior de SEM de nanoparches de Ag pulverizados durante 60 s, (D) Nanoparches de Ag y Pt pulverizados conjuntamente durante 60 s, (E) imagen TEM de nanoparches de Ag y Cu pulverizados durante 60 s en una rejilla TEM, (F) nanoparches de Cu sobre Ag pulverizados secuencialmente durante 60 s en una rejilla TEM. (E, F) tomado de la referencia 18.

Para comparar cualitativamente las propiedades antimicrobianas y antivirales de las superficies de Ag y Cu pulverizadas, primero evaluamos las propiedades antibacterianas de nanoparches de ánodo de sacrificio delgados de Ag/Pt y Ag/Cu. Las pruebas bacterianas se realizaron con Staphylococcus aureus (S. aureus) utilizando una configuración experimental basada en gotas que permite el análisis de bacterias planctónicas y adherentes. Las bacterias planctónicas dentro de la gota se cuantificaron sembrando en placas de agar sangre, mientras que las bacterias adherentes en la superficie de la muestra se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia.

Las películas delgadas de Ti puro, así como los nanoparches delgados de Pt, Ag y Cu puros sirvieron como controles y no exhibieron actividad antibacteriana significativa contra S. aureus (Fig. 3A). Del mismo modo, el crecimiento bacteriano no se vio afectado por nanoparches delgados de Ag/Pt co-depositados, lo que indica la ausencia de un efecto de ánodo de sacrificio (Fig. 3B). Por el contrario, los nanoparches finos de Ag/Pt depositados secuencialmente, así como los nanoparches finos de Ag/Cu depositados conjuntamente y secuencialmente, previnieron eficazmente el crecimiento bacteriano después de 24 h de incubación (Fig. 3B).

Actividad antibacteriana frente a S. aureus (104 UFC/mL) de (A) una película delgada continua de Ti (control de Ti), así como nanoparches delgados de Pt, Ag y Cu pulverizados en una película delgada de Ti en comparación con (B) Ag/Pt delgada y nanoparches finos de Ag/Cu pulverizados simultáneamente (es decir, codepositados) o secuencialmente (primero Pt, segundo Ag o primer Ag, segundo Cu). Tiempo de pulverización catódica para todas las muestras 60 s. Cifras superiores: imágenes de fluorescencia representativas de bacterias adherentes en superficies de muestra después de 24 h de incubación y tinción con SYTO-9 (fluorescencia verde); imágenes inferiores: placas de agar sangre representativas de bacterias planctónicas sembradas en el líquido de la gota después de 24 h de incubación en las diferentes muestras (las colonias bacterianas blancas indican células viables).

Como generalmente se acepta que la actividad antibacteriana de Ag y Cu está fuertemente relacionada con la liberación de iones y su interacción con los componentes y procesos celulares, se utilizaron soluciones de acetato de plata (AgAc) y sulfato de cobre (CuSO4) como controles iónicos para la actividad antibacteriana de Ag y Cu hacia las bacterias grampositivas S. aureus13,14. Se detectaron efectos antibacterianos significativos para AgAc en concentraciones ≥ 1,0 µg/mL, mientras que CuSO4 provocó efectos significativos a partir de concentraciones ≥ 5,0 µg/mL (Fig. 4).

Análisis cuantitativo de la actividad antibacteriana de soluciones de acetato de plata (AgAc, panel A) y sulfato de cobre (CuSO4, panel B) frente a S. aureus (diferentes concentraciones bacterianas) realizado por el ensayo AlamarBlue. Los datos se expresan como media ± DE de al menos tres experimentos independientes y se dan como porcentaje de bacterias no tratadas (sin exposición). Los asteriscos (*) indican diferencias significativas (*p ≤ 0,05) en comparación con el control sin tratar; las marcas hash indican diferencias significativas (*p ≤ 0,05) entre AgAc y CuSO4.

Estos resultados indican que la ausencia de efectos antibacterianos de los nanoparches de Ag y Cu puros se debe a una liberación de iones insuficiente de estas estructuras, mientras que la combinación de Ag y Pt, así como de Ag y Cu, conduce a una actividad antibacteriana mejorada basada en una disolución mejorada impulsada electroquímicamente. de Ag y Cu, respectivamente (Fig. 3). Previamente, demostramos tales efectos de ánodo de sacrificio para sistemas Ag/Pt nanoparticulares y nanoestructurados11,12,15. Con respecto al sistema Ag/Cu, además de un posible efecto de ánodo de sacrificio de Ag sobre Cu, se podría considerar un efecto combinado de los dos metales antibacterianos10,12.

Después de demostrar los efectos antibacterianos de las superficies de Ag y Cu pulverizadas, así como de las soluciones iónicas de Ag y Cu, de acuerdo con los resultados anteriores, nuestro siguiente paso fue analizar los posibles efectos antivirales de estas superficies contra el SARS-CoV-2. La contaminación viral se simuló tras la inoculación de SARS-CoV-2 en las superficies durante 1 h o 24 h, antes de determinar los títulos virales como TCID50/mL (Fig. 5). Se observó una eficacia antiviral pronunciada para películas finas de Cu pulverizadas sobre piezas de Si/SiO2 después de 1 h y 24 h de incubación, lo que redujo los títulos virales en 3 log10 y 4,5 log10, respectivamente, mientras que las películas de Ag no redujeron los títulos virales (Fig. 5A). Por el contrario, las superficies de Ag pulverizadas solo afectaron marginalmente y no significativamente los títulos virales tras una exposición de 24 h. El análisis ICP-MS sugirió que estas películas liberan iones Cu en el rango de 10 000 a 14 200 µmol/L durante 24 h, lo que indica que esta cantidad es suficiente para la inactivación eficiente del SARS-CoV-2 (Fig. 1 complementaria). Si bien los nanoparches de Ag no afectaron la infectividad viral, los nanoparches con una capa gruesa de Cu redujeron los títulos virales en 1 log10 cuando se incubaron junto con SARS-CoV-2 durante 24 h (Fig. 5B), lo que resultó en una liberación de iones de alrededor de 720 µmol/ L (Fig. 1 complementaria). Curiosamente, los nanoparches Cu & Ag y Cu on Ag mejoraron las propiedades antivirales del Cu únicamente, con un efecto antiviral significativo después de 24 h, a pesar de que se liberaron cantidades similares de Cu (870 µmol/L, Fig. 1 complementaria). Esto podría estar relacionado con el mecanismo electroquímico mejorado de liberación de iones Cu en la estructura del ánodo de sacrificio, donde el Cu puede oxidarse fácilmente y liberarse al medio como iones Cu, debido a la presencia de Ag, que respaldan el proceso de reducción. Las capas delgadas redujeron los títulos virales en 2,2 log10, mientras que las capas gruesas aumentaron la inactivación del virus, lo que resultó en factores de reducción de 3,9 log10 (Fig. 5C). No hubo diferencia en el efecto antiviral detectado entre los nanoparches depositados conjuntamente y secuencialmente. Esto demuestra que las películas de Cu puro ofrecen el mayor efecto antiviral (Fig. 5A), que se correlaciona con la mayor liberación de iones (13 000 µmol/L, Fig. 1 complementaria). Por el contrario, los nanoparches de Ag-Pt co-depositados y depositados secuencialmente no redujeron la infectividad viral dentro de 1 h de incubación. Se observó un efecto antiviral leve, pero no significativo (reducción de 1 log10 de los títulos virales) después de 24 h de incubación con nanoparches finos de Ag y Pt y Ag fino sobre Pt (Fig. 5D). Para examinar más a fondo la observación de que las superficies recubiertas con Ag no afectan la infectividad viral, utilizamos soluciones de acetato de plata (AgAc) como referencia para probar las propiedades antivirales de Ag a concentraciones de iones más altas en comparación con lo que se puede liberar de una película delgada. superficie o una estructura de nanoparches. Incluimos concentraciones que iban desde 1 µg/ml hasta 50 µg/ml de Ag e inoculamos la solución con sobrenadante que contenía SARS-CoV-2 durante 1 h o 24 h antes de determinar la infectividad viral como TCID50/ml. Solo concentraciones iguales o superiores a 25 µg/mL mostraron propiedades antivirales y abolieron completamente la infectividad del SARS-CoV-2, sin embargo, solo después de una incubación prolongada de 24 h (Fig. 5E). Por el contrario, la exposición del virus a la solución de CuSO4 en una configuración experimental similar no tuvo efecto sobre los títulos virales (Fig. 5F). En conclusión, demostramos un claro efecto antiviral de las superficies recubiertas de Cu contra el SARS-CoV-2 dentro de una exposición de 1 h, mientras que las superficies recubiertas de Ag no influyeron en la infectividad viral.

Resultados de la actividad antiviral para (A) películas delgadas de Cu y Ag pulverizadas en piezas de Si/SiO2 o (B–D) nanoparches pulverizados en Si/SiO2 que se incubaron con SARS-CoV-2 durante los períodos de tiempo indicados. (E–F) Las soluciones de acetato de plata (AgAc) y sulfato de cobre (CuSO4), utilizadas como controles iónicos, se enriquecieron con SARS-CoV-2 y se incubaron durante períodos de tiempo similares. El virus infeccioso residual se cuantificó mediante el cálculo de TCID50. La línea punteada indica el límite inferior de cuantificación. Los datos se expresan como media ± SD de tres experimentos independientes. Los asteriscos (*) indican diferencias significativas (*p < 0,05; **p < 0,01; y ***p < 0,001) en comparación con MOCK (control no tratado) o Si/SiO2.

Se necesitan urgentemente medidas de prevención rápidas y eficaces para combatir las enfermedades microbianas y virales. La transmisión de fómites a través de superficies contaminadas se describió para una variedad de microbios, incluidos varios virus, y se ha discutido en el contexto de COVID-19. Aunque se cree que las superficies juegan un papel menor en la propagación del SARS-CoV-2, las estrategias de intervención de salud pública todavía se basan en procedimientos desinfectantes para reducir la transmisión viral. Se han sugerido varios revestimientos superficiales que exhiben actividad antimicrobiana inducida topográfica y/o químicamente, incluidos materiales nanoestructurados y materiales que contienen agentes antimicrobianos (p. ej., antibióticos, medicamentos antivirales, nanopartículas) como láminas antibacterianas/antivirales disponibles en el mercado, textiles, pinturas y muchos otros. más19,20. Aunque la desinfección puede ser eficaz en la prevención de la propagación de infecciones, los agentes biológicamente activos de muchos desinfectantes de superficies y manos ampliamente utilizados también pueden ser peligrosos para los seres humanos y el medio ambiente, especialmente en aplicaciones prolongadas o mal uso. En particular, puede ocurrir irritación cutánea y ocular, así como quemaduras químicas en las vías respiratorias. La alteración de la flora normal de la piel, que normalmente representa una barrera de protección frente a agentes nocivos, puede incluso aumentar el riesgo de infección21.

De acuerdo con van Doremalen et al., el SARS-CoV-2 fue menos estable en superficies de Cu pulverizadas en comparación con todas las demás películas delgadas de este estudio18. Una película más gruesa condujo a un efecto antiviral más pronunciado. Las nanoestructuras de Cu, por el contrario, redujeron el efecto antiviral, lo que puede atribuirse a la cantidad reducida de iones de Cu liberados. Curiosamente, la combinación de Cu con Ag mediante la pulverización conjunta o el depósito secuencial de Cu sobre Ag fortaleció los efectos antivirales para las estructuras a nanoescala (nanoparche de Cu en comparación con el nanoparche de Ag-Cu), especialmente después de una incubación prolongada de 24 h, según lo supervisado por ensayos de dilución limitada. . Por el contrario, las películas delgadas de nanoparches de ánodo de sacrificio basados en Ag puro o Ag (Ag en combinación con Pt) no mostraron una capacidad significativa para inactivar el SARS-CoV-2 (Fig. 5B-D), a pesar de la liberación eficiente de iones de Ag. Los experimentos de control iónico demostraron que se necesita una concentración mínima de ≥ 25 µg/mL para reducir significativamente los títulos virales cuando se incuba durante 24 h. La reducción de la concentración de acetato de plata o el período de incubación eliminó por completo cualquier efecto antiviral (Fig. 5E). Esto significa que solo concentraciones muy altas de iones Ag tienen un efecto sobre el SARS-CoV-2. En el pasado, la mayoría de las nanopartículas (NP) usadas para estudios sobre actividades antivirales estaban hechas de Ag (para una revisión ver 20,21). Por ejemplo, la infectividad del VIH-1 se inhibió en concentraciones de 25 µg Ag/mL y superiores19,21. Recientemente, Jeremías et al. informaron que las Ag NP (10 nm) ya eran efectivas en concentraciones más bajas al inhibir el SARS-CoV-2 extracelular en concentraciones entre 1 y 10 µg/mL22, sin embargo, es posible que las nanopartículas ejerzan un efecto de partícula adicional sobre los virus después de la unión, como el efecto estérico inhibición. Además, una mezcla de nanopartículas en solución que contenía Au-NP (1 µg/mL) y Ag-NP (5 µg/mL) fue efectiva contra el SARS‑CoV‑2 y los virus de la influenza, sin embargo, esta mezcla también contenía grandes cantidades (60 µg/mL) de ZnO-NPs y adicionalmente ClO223. En general, se debe considerar que los estudios con nanopartículas no son directamente comparables con los estudios sobre películas delgadas (o material a granel delgado) debido a varios factores, como superficie ampliada, alta liberación de iones, absorción en las células, interacción electrostática, interacción estérica en caso de las partículas pequeñas y otros factores. Nuestros resultados en superficies de película delgada, nanoparches y soluciones iónicas indican claramente diferencias entre las actividades antiviral y antibacteriana de Ag. Para la inactivación del SARS-CoV-2, se requieren concentraciones diez veces más altas de iones Ag en comparación con las concentraciones antibacterianas eficientes. La razón puede estar relacionada con la diferencia en la naturaleza de los virus frente a las bacterias. Como organismos vivos, las bacterias ofrecen procesos metabólicos mucho más sensibles a Ag, como la generación de energía o la proliferación celular, en comparación con una partícula de virus. Además, algunas bacterias como S. aureus exhiben una tolerancia inherente significativa al crecimiento a altas concentraciones de Cu24. Sin embargo, una solución de sulfato de cobre de hasta 50 µg/mL no inactivó el SARS-CoV-2 (Fig. 5F). En nuestro estudio, las soluciones iónicas de Ag y Cu tenían una concentración similar de hasta 50 µg de metal/mL para permitir una comparación directa. Mientras que el Ag iónico es antibacteriano en concentraciones de ≥ 1 µg/mL, el Cu iónico se requiere en concentraciones mucho más altas para inhibir el crecimiento bacteriano (p. ej., CuSO4 10 mM). Varios grupos observaron diferencias similares en la eficiencia antibacteriana entre los iones Ag y Cu24,25,26, sin embargo, a concentraciones de iones totales más bajas debido al medio de prueba de agua26. Por lo tanto, a concentraciones equimolares, los iones Ag muestran un mejor rendimiento antibacteriano en comparación con los iones Cu. La inhibición del virus por iones de Cu solubles podría requerir concentraciones más altas por encima de los valores máximos utilizados (50 µg/mL) en nuestros experimentos.

A diferencia de las especies iónicas, las actividades antibacteriana y antiviral de las superficies sólidas pulverizadas de Ag y Cu han dado lugar a resultados diferentes. Los nanoparches de Ag pura no exhiben actividades antibacterianas ni antivirales. Obviamente, la liberación de iones Ag es insuficiente en estas condiciones experimentales. Para superar esta liberación limitada de iones de Ag, se pueden usar las superficies de ánodo de sacrificio que liberan iones más activas, ya que exhiben una eficacia antibacteriana mucho mejor incluso con un contenido de Ag total más bajo11,12, como también se observó aquí para las muestras de Ag/Pt (Fig. 3) . Sin embargo, incluso estas muestras antibacterianas de Ag/Pt no lograron inducir ningún efecto antiviral, lo que indica nuevamente la necesidad de concentraciones más altas de iones de Ag para alcanzar la actividad antiviral.

Sorprendentemente, nuestro estudio muestra que el Cu en estado sólido, ya sea como una película densa o como nanoparches, puede inducir actividad antiviral, pero no Ag en estado sólido. Los efectos antivirales dependen de la cantidad total de Cu (espesor de la liberación de iones y Cu pulverizado) y del tiempo de exposición de la muestra.

Se informó que los compuestos cuprosos en estado sólido exhiben actividades antivirales eficientes, mientras que las de Ag en estado sólido son notablemente más bajas27. En particular, la inactivación de las proteínas de superficie HA y NA del virus de la influenza se ve afectada por la exposición a Ag y Cu28. El Ag en estado sólido es menos susceptible que el Cu en estado sólido a la oxidación superficial bajo las condiciones experimentales para liberar especies iónicas29. Se sabe que varios productos metabólicos del Cu, como el óxido cuproso (Cu2O), el sulfuro (Cu2S) o el cloruro (CuCl), exhiben altas actividades antivirales y las superficies de Cu conservan sus propiedades antiinfecciosas incluso después de la formación del óxido27,30.

Aunque existen numerosos informes sobre los efectos antibacterianos y antivirales de Ag o Cu y sus compuestos relacionados, rara vez se encuentra una comparación directa de Ag y Cu como se realizó en nuestro estudio, que incluye datos tanto bacterianos como virales y una alta variabilidad de los métodos de estudio informados. dificulta tal comparación directa31.

Recientemente, se informó la rápida inhibición del SARS-CoV-2 en superficies nanohíbridas de cobre-plata (Cu-Ag) y los autores atribuyeron el papel de la inhibición primaria del SARS-CoV-2 al contenido de Cu32. Nuestros resultados mostraron que la combinación de Cu y Ag (nanoparches de Cu y Ag) ejercía una actividad antiviral significativamente mayor que los nanoparches similares que consisten solo en Cu o Ag. Este efecto se puede atribuir a la mayor liberación de iones de Cu de los nanoparches de Cu y Ag junto con una profunda disminución en la liberación de iones de Ag en comparación con los nanoparches de Ag. Aparentemente, la presencia de plata es necesaria para permitir los efectos antivirales a través de nanoparches. Estos hallazgos sugieren que los procesos electroquímicos, como el efecto del ánodo de sacrificio, pueden desempeñar un papel importante. Sin embargo, los mecanismos exactos para esto aún deben aclararse en estudios posteriores.

En conjunto, las superficies biocidas podrían proporcionar una eficacia antiviral y antibacteriana constante contra la contaminación recurrente, reduciendo así la propagación de ciertos patógenos, dado que la superficie se mantiene limpia y no se agota, mientras que la desinfección de la superficie debe volver a aplicarse con cada contaminación33. La actividad antimicrobiana de los materiales y superficies a base de Cu se demostró contra diferentes patógenos, incluidos el SARS-CoV-2, MRSA (S. aureus resistente a la meticilina), VRE (enterococos resistentes a la vancomicina) y otros patógenos nosocomiales, mientras que técnicas como el frío -el recubrimiento por aspersión o la impregnación de Cu evitarían la necesidad de reemplazar completamente las superficies existentes34,35,36. Sin embargo, los períodos de incubación superiores a 1 h no son aplicables para muchas administraciones y, por lo tanto, las medidas de prevención deben evaluarse críticamente con respecto al patógeno objetivo.

Las muestras de película delgada se prepararon mediante pulverización catódica con magnetrón de corriente continua en atmósfera de Ar (0,5 Pa) a temperatura ambiente sobre sustratos de Si oxidados térmicamente (Si/SiO2, 4,4 mm × 4,4 mm), que se colocaron en una placa de sustrato giratoria. Se utilizaron blancos de pulverización catódica, de 2 pulgadas de diámetro, de Cu (99,99% de pureza, EvoChem), Ag (99,99%, EvoChem) y Pt (99,99%, ESG Edelmetall Services). Los datos de todas las películas se enumeran en la Tabla 1. El grosor nominal de las películas se calculó a partir de las tasas de pulverización catódica predeterminadas de los elementos usados y los niveles de potencia indicados. En la figura 1 se muestran ejemplos de imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Las pruebas bacterianas se realizaron con Staphylococcus aureus (S. aureus, DSMZ 1104) obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania). Los cultivos de S. aureus se cultivaron durante la noche en caldo de infusión de cerebro y corazón (caldo BHI, bioMerieux, Lyon, Francia) a 37 °C usando un baño de agua con agitación (JULABO GmbH, Seelbach, Alemania) y las concentraciones bacterianas se determinaron mediante mediciones de turbidez (Densichek fotómetro de turbidez, bioMerieux). La adhesión y proliferación de S. aureus en las diferentes muestras de nanoparches se analizaron utilizando una configuración experimental basada en gotas como se informó anteriormente10,11. Brevemente, se colocaron 30 µL de una solución bacteriana en caldo BHI que contenía 104 células por mL (CFU/mL) en el medio de cada muestra de prueba seguido de incubación durante 24 h en una cámara húmeda (atmósfera saturada de agua) en condiciones de cultivo celular ( 37 °C, 5 % CO2). Posteriormente, las gotas fueron aspiradas, diluidas en serie (1:104) y sembradas en placas de agar sangre Columbia (bioMerieux) para el análisis cuantitativo de bacterias planctónicas. El análisis cualitativo de las bacterias adherentes se realizó mediante tinción SYTO-9 (Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se detectó mediante microscopía de fluorescencia (microscopio BX61, Olympus, Hamburgo, Alemania).

Se utilizaron soluciones de acetato de plata (AgC2H3O2, AgAc) y sulfato de cobre (CuSO4) como controles iónicos para la actividad antimicrobiana de Ag y Cu, respectivamente. Cada solución se preparó en agua ultrapura estéril y se normalizó al contenido total de metales (es decir, por ejemplo, 100 µg/ml de AgAc contienen 100 µg/ml de Ag). Se incubaron diferentes concentraciones bacterianas (103, 104, 105 CFU/mL) de S. aureus en BHI durante 24 h con diferentes concentraciones de soluciones de AgAc y CuSO4 (0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10, 25, 50 µg/mL) en microplacas de 96 pocillos con un volumen de muestra total de 200 µl en condiciones de cultivo celular. Posteriormente, se realizó la cuantificación de células viables mediante el ensayo AlamarBlue. Por lo tanto, las suspensiones bacterianas se incubaron con 20 µL del reactivo AlamarBlue (Invitrogen) hasta el cambio de color visible y se analizó la intensidad de la fluorescencia a 590 nm mediante un lector de microplacas (FLUOstar Optima, BMG LABTECH GmbH, Ortenberg, Alemania). Los datos de los cultivos tratados (media ± SD) se dan como porcentaje de los controles no tratados (bacterias cultivadas sin AgAc o CuSO4).

Para evaluar la capacidad de inactivación de películas delgadas pulverizadas en piezas de Si/SiO2 (ver Deposición de películas delgadas por pulverización), 25 µL de SARS-CoV-2 (hCoV-19/Alemania/BY-Bochum-1/2020; ID de registro de GISAID: EPI_ISL_1118929; 8,8 × 106 TCID50/mL) en el centro de cada muestra de prueba y se incubó durante 1 h y 24 h a temperatura ambiente (22 ± 1 °C) y 32 ± 1 % de humedad. El virus se recuperó añadiendo 225 µL de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, suplementado con 10 % (v/v) de suero de ternero fetal (FCS), 1 % (v/v) de aminoácidos no esenciales, 100 UI/mL de penicilina, estreptomicina 100 µg/mL y L-Glutamina 2 mM). Posteriormente, los títulos virales se determinaron mediante un ensayo de dilución de punto final realizado en células VeroE6 (amablemente proporcionadas por C. Drosten y M. Müller) sembradas a 5 × 104 células/mL en DMEM un día antes de la titulación. El TCID50 restante se calculó según Spearman y Kärber.

De acuerdo con las pruebas antimicrobianas se utilizaron soluciones de acetato de plata y sulfato de cobre como controles iónicos. Por lo tanto, el SARS-CoV-2 se enriqueció con diferentes concentraciones de soluciones de AgAc y CuSO4 (1,0, 2,5, 5,0, 10, 25, 50 µg/ml) y se incubó durante 1 hora y 24 horas a temperatura ambiente. Los títulos virales restantes se cuantificaron nuevamente mediante un ensayo de dilución de punto final seguido del cálculo de TCID50.

Se usó ICP-MS para determinar la cantidad de iones liberados en el medio que contenía el virus durante el contacto con la superficie de interés. Las diluciones se ajustaron a un rango de calibración entre 1 y 100 ppb, que representa la parte de mayor concentración de la curva de calibración lineal. De acuerdo con las medidas de calibración, las muestras se acidificaron con HNO3 al 2%. Para permitir múltiples mediciones o ajustar aún más la dilución de la misma muestra, se obtuvieron 10 mL de solución de muestra agregando 300 µL de HNO3 ultrapuro al 69 % (Roth, calidad Supra), mezclando a fondo y llenando hasta 10 mL para ajustar una concentración de ácido del 2%. Las muestras se analizaron con un sistema iCAP RQ de Thermo Fisher Scientific en modo KED.

El análisis estadístico de los efectos antibacterianos se realizó mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Bonferroni. El análisis estadístico de los efectos antivirales se realizó mediante ANOVA de dos vías en un análisis de efectos mixtos con comparación múltiple de Dunnet. Los valores de p ≤ 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

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Descargar referencias

Agradecemos a todos los miembros del Departamento de Virología Molecular y Médica por sus útiles sugerencias y debates. Agradecemos al Sr. Martin Trautmann de la Cátedra de Química Analítica (Prof. Dr. Wolfgang Schuhmann) de la Ruhr University Bochum por las mediciones de ICP-MS. Se reconoce el ZGH para el acceso al SEM.

Agradecemos el apoyo de Open Access Publication Funds de la Ruhr-Universität Bochum. ES fue apoyado por VIRus ALLiance NRW (VIRAL) del Ministerio de Cultura y Ciencia del Estado de Renania del Norte-Westfalia (Subvención No. 323-8.03-151826) y por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) – Subvención No. .458338078. SP fue financiado por la DFG - Subvención No. 458610711. Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Estos autores contribuyeron por igual: Toni Luise Meister, Jill Fortmann y Marina Breisch.

Departamento de Virología Molecular y Médica, Ruhr University Bochum, Universitätsstr. 150, 44780, Bochum, Alemania

Toni Luise Meister, Eike Steinmann y Stephanie Pfaender

Presidente de Descubrimiento de Materiales e Interfaces, Ruhr University Bochum, Universitätsstr. 150, 44780, Bochum, Alemania

Jill Fortmann y Alfred Ludwig

BG University Hospital Bergmannsheil Bochum, Surgical Research, Ruhr University Bochum, Buerkle de la Camp Platz-1, 44789, Bochum, Alemania

Marina Breisch, Christina Sengstock y Manfred Köller

Instituto Leibniz de Ciencias Analíticas - ISAS - eV, Bunsen-Kirchhoff-Strasse 11, 44139, Dortmund, Alemania

cristina sengstock

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Concepción y diseño: MB, CS, ES, MK, SP, AL; Adquisición y análisis de datos: TLM, JF, MB; Interpretación de datos: TLM, JF, MB, CS, ES, MK, SP, AL; Escritura: TLM, JF, MB, CS, ES, MK, SP, AL

Correspondencia a Stephanie Pfaender o Alfred Ludwig.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Meister, TL, Fortmann, J., Breisch, M. et al. Los sistemas de película delgada de cobre y plata a nanoescala muestran diferencias en las propiedades antivirales y antibacterianas. Informe científico 12, 7193 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11212-w

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Recibido: 29 de octubre de 2021

Aceptado: 12 abril 2022

Publicado: 03 mayo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11212-w

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